邵萌 ，吴芳，张杰，董江涛，柳小玲，吴江东，章乐，赵海军*，张万江*

    结核病是由结核分枝杆菌感染引起的严重危害人类健康的世界性传染病。2015—2018 年全球结核病死亡总人数减少了11%，却未实现2020 年减少35%这一终结结核病战略里程碑目标的1/3[1]。可见结核病的预防和诊治任务依然艰巨。目前，虽然唯一批准并被广泛应用的卡介苗(BCG)对儿童粟粒性结核病和结核性脑膜炎的预防效果较好，但其对成人的保护率很不稳定(0～80%)[2]，保护期只能维持约15 年[3]，因此研发新的结核病疫苗来替代或促进BCG 的长久保护十分必要。

    本课题组前期利用原生质体技术及电穿孔技术，以BCG 和结核分枝杆菌国际标准无毒株——H37Ra 菌株(以下简称H37Ra 菌株)为亲本，构建及选育的新型结核病疫苗菌株——B/R 菌株(详细制备方法已申请国家发明专利，专利申请号2019100713800，公布号CN109825497A)在使用的安全性、毒性、定殖能力及传代稳定性方面表现出较好的候选结核病疫苗的潜能[4-5]。不可忽略的是，T 淋巴细胞特异性免疫应答是评价结核病疫苗保护效果的重要指标，其主要特征是免疫记忆和特异性[6]，因此，该研究以B/R 菌株为研究对象，比较BCG、H37Ra 菌株和B/R 菌株分别免疫小鼠后，在遇到相同抗原刺激时，对T 淋巴细胞免疫记忆的影响，并进一步探讨B/R 菌株诱导的特异性细胞免疫应答类型，以及T 淋巴细胞的增殖能力，为B/R 菌株作为新型结核病疫苗的临床前研究奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 菌种 BCG 和H37Ra 菌株由中国食品药品检定研究院提供，B/R 菌株由本研究室构建保存。

    1.2 实验动物 2019 年1 月，选取6～8 周龄、SPF 级雌性C57BL/6 小鼠48 只，购自新疆医科大学实验动物研究中心，饲养于石河子大学医学院实验动物中心，每笼3～5 只，自由饮食，定期通风消毒。研究按国家实验动物学会的指导方针进行。

    1.3 主要试剂 小鼠脾淋巴细胞分离液试剂盒购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，1640 培养基购自HyClone 公司，胎牛血清购自Gibco 公司，CFSE、anti-CD28、Anti-Mouse CD4PE-Cy5、Anti-Mouse CD8a PE-Cy5、Anti-Mouse CD62L PE、Anti-Human/Mouse CD44FITC 购 自eBioscience 公 司，Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4 ELISA Kit 购自杭州联科生物技术股份有限公司 ......