纳米微囊-VEGF复合体转染对慢性创面愈合影响的研究(1)
[摘要]目的：研究纳米微囊-VEGF复合体转染对慢性创面愈合的影响。方法：以VEGF为目的基因，构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA-VEGF165，纳米微囊包裹后作用于兔耳慢性创面，于术后14天通过创面观察以及组织学染色、显微测量，观察其对创面的影响。结果：转基因组创面肉芽生长及上皮爬行速度明显快于慢性创面组；HE染色转基因组肉芽组织中大量的成纤维细胞聚集，微血管数量增多；新生上皮生长NEG在非缺血创面组最高，慢性创面组最低，其中前者较后者增加249%，而转基因组较慢性创面组增加了165%；肉芽组织厚度PH转基因组较慢性创面组增加了70%，而非缺血创面组较慢性创面组增加了46%；肉芽组织体积NGTV在转基因组及非缺血创面组与慢性创面组比较，分别增加了317%、302%。结论：非病毒载体纳米微囊-VEGF复合体能明显促进慢性创面愈合。
[关键词]血管内皮生长因子；慢性创面；愈合；纳米微囊；转染
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)03-0291-04
, 百拇医药
慢性创面的治疗一直是临床工作的难题之一。随着社会人口老龄化，临床病例日渐增多，促使我们不断探索新的治疗途径。近年来，外源性生长因子的应用成为研究热点，并取得一定成绩。而慢性创面愈合的一个关键环节是新生血管的形成，其中VEGF是已知作用最强的血管生成调控因素Ⅲ。因此，深入研究VEGF在慢性创面形成中的作用具有深远的意义。目前国外文献已有外源性重组VEGF在传统兔耳缺血创面模型的应用报道，但VEGF在创面快速降解的特性也使其给药途径具有局限性。
本实验将纳米微囊非病毒截体基因转移技术应用于兔耳慢性创面研究，这种技术具有无免疫原性、较高的转染效率，以及长时间缓释功能等优越性。实验证实外源性VEGF基因局部应用可以明显促进兔耳慢性创面的愈合，为临床应用提供依据。
1 材料和方法
1.1 纳米微囊-VEGF复合体的制备：参考相关文献资料制备带有VEGF的真核表达载体(pcDNA3.1/myc-hisA-VEGF)，取25μl 1.70D上述载体，PBS稀释至50μl，与10mM纳米微囊50μl涡旋振荡混匀，静置30min。100μl为每个创面滴加量。纳米微囊-空载质粒(不含VEGF基因)作为对照。
, 百拇医药
1.2 动物模型制作及分组：健康新西兰白兔8只，48～60月龄，体重3.9～5.0kg(第四军医大学实验动物中心提供)，利用我们白建的方法构建兔耳慢性难愈性创面模型。在耳腹侧制成3个慢性创面的同时，另在环切部位的近端腹侧皮肤制备一个φ=6mm的圆形创面，作为非缺血对照。据此将本实验共分为三组：转基因组(一侧兔耳慢性创面滴加纳米微囊-VEGF复合体，以CW+VEGF表示)、慢性创面组(另侧兔耳慢性创面滴加空载质粒，以CW表示)、非缺血创面组(双侧兔耳非缺血创面滴加空载质粒，以NW表示)。创面包扎、手术环节等步骤均同原文。①CW+VEGF组：明胶海棉薄片蘸取100μl纳米微囊-VEGF复合体覆于每个创面；②CW组：明胶海棉薄片蘸取100μl空载质粒覆于每个创面；③Nw组：明胶海棉薄片蘸取100μl空载质粒覆于每个创面。
1.3 取材：术后14天全部动物处死，以每一创面为中心，切取1cmx 1cm正方形组织块(含兔耳全层)，并自创面正中对称二等分切开。标本迅速固定于中性福尔马林液，常规石蜡包埋、切片(厚度5μm)、HE染色。
, http://www.100md.com
1.4 创面观察：观察各组创面肉芽组织生长情况。
1.5 组织学观测：创面横断面HE染色，镜下观察创缘新生肉芽组织增生情况，并以显微测微标尺精确测量上皮间距EG(Epithelial Gap)、肉芽组织间距GTG(Granulation Tissue Gap)及肉芽组织最大厚度PH(Peak Height)，从而得到反映创面愈合的三个重要指标：①新生上皮生长NEG(New EpithelialGrowth)=6mm-EG；②肉芽组织体积NGTV(NewGranularion Tissue Volume)=肉芽组织面积×PH，其中肉芽组织面积=[(6-GTG)/2]2×π；③肉芽组织最大厚度PH。
1.6 统计学处理：所得数据采用SPSS10.0统计软件对数据进行ANOVA和post-hoc检验，分析组间和两两差异，显著性差异标准a为0.05。
2 结果
, http://www.100md.com
在术后3天，CW+VEGF组及NW组已见创缘有很少量肉芽形成及上皮爬行，色泽鲜红，在7天时生长已很明显。而CW组7天时尚未见明显肉芽组织形成。术后14天，CW组有少量肉芽及上皮化出现，而其它两组已有多量新生组织，颜色较3天及7天时稍淡，其中有3例创面完全愈合。
HE染色显示，14天时CW组表皮层完整，肉芽组织中大量炎细胞浸润，但成纤维细胞及新生血管管腔数量少；而CW+VEGF组新生表皮层较厚，表皮突明显，肉芽组织中大量的成纤维细胞聚集，微血管数量增多，仅散在少量炎细胞浸润。Nw组与CW+VEGF组差距不明显。这说明在肉芽组织生长期CW组肉芽增生缓慢，而其他两组肉芽增生活跃。
在术后14天，新生上皮生长NEG在三组之间两两比较均有统计学意义，P<0.05。Nw组最高，CW组最低，其中NW组较CW组增加249%，而CW+VEGF组较CW组增加了165%。肉芽组织厚度PH在三组间两两比较也有显著性差异，P<0.05。CW+VEGF组较CW组增加了70%，而NW组较CW组增加了46%。肉芽组织体积NGTV在CW+VEGF组及NW组无明显差异，但与CW组比较均有统计学意义，P<0.05。它们分别增加了317%、302%。以上结果表明：与非缺血创面相比，慢性创面的肉芽组织生长及上皮化速度明显下降；而转基因组全面提高了慢性创面的愈合指标数据，尤其对肉芽组织增生(PH)的促进作用较上皮化作用(NEG)更强。
3 讨论
近年来的大量研究表明，生长因子可以在一定程度上促进创面愈合，而血管内皮生长因子(VEGF)就是其中一类，又称血管渗透因子(VPF)，它是牛垂体星状细胞体外培养分离出的一种糖蛋白。根据VEGF mRNA的剪接方式不同，存在5种变异体，分别是：VEGF121、165、189、206、145，其中VEGF165是最多见的蛋白表达形式。它最主要的功能表现在两个方面：①它在体内体外都特异性地促进血管内皮细胞的增殖并诱导血管生成，是目前最强的促血管内皮细胞有丝分裂原：⑦它还可以增强微血管通透性，导致血浆蛋白广泛的外漏，其中包括纤维蛋白原、血浆酶原、纤维粘连蛋白等，这些, http://www.100md.com(彭 湃 韩 岩 杨 力 夏文森)
[关键词]血管内皮生长因子；慢性创面；愈合；纳米微囊；转染
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)03-0291-04
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慢性创面的治疗一直是临床工作的难题之一。随着社会人口老龄化，临床病例日渐增多，促使我们不断探索新的治疗途径。近年来，外源性生长因子的应用成为研究热点，并取得一定成绩。而慢性创面愈合的一个关键环节是新生血管的形成，其中VEGF是已知作用最强的血管生成调控因素Ⅲ。因此，深入研究VEGF在慢性创面形成中的作用具有深远的意义。目前国外文献已有外源性重组VEGF在传统兔耳缺血创面模型的应用报道，但VEGF在创面快速降解的特性也使其给药途径具有局限性。
本实验将纳米微囊非病毒截体基因转移技术应用于兔耳慢性创面研究，这种技术具有无免疫原性、较高的转染效率，以及长时间缓释功能等优越性。实验证实外源性VEGF基因局部应用可以明显促进兔耳慢性创面的愈合，为临床应用提供依据。
1 材料和方法
1.1 纳米微囊-VEGF复合体的制备：参考相关文献资料制备带有VEGF的真核表达载体(pcDNA3.1/myc-hisA-VEGF)，取25μl 1.70D上述载体，PBS稀释至50μl，与10mM纳米微囊50μl涡旋振荡混匀，静置30min。100μl为每个创面滴加量。纳米微囊-空载质粒(不含VEGF基因)作为对照。
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1.2 动物模型制作及分组：健康新西兰白兔8只，48～60月龄，体重3.9～5.0kg(第四军医大学实验动物中心提供)，利用我们白建的方法构建兔耳慢性难愈性创面模型。在耳腹侧制成3个慢性创面的同时，另在环切部位的近端腹侧皮肤制备一个φ=6mm的圆形创面，作为非缺血对照。据此将本实验共分为三组：转基因组(一侧兔耳慢性创面滴加纳米微囊-VEGF复合体，以CW+VEGF表示)、慢性创面组(另侧兔耳慢性创面滴加空载质粒，以CW表示)、非缺血创面组(双侧兔耳非缺血创面滴加空载质粒，以NW表示)。创面包扎、手术环节等步骤均同原文。①CW+VEGF组：明胶海棉薄片蘸取100μl纳米微囊-VEGF复合体覆于每个创面；②CW组：明胶海棉薄片蘸取100μl空载质粒覆于每个创面；③Nw组：明胶海棉薄片蘸取100μl空载质粒覆于每个创面。
1.3 取材：术后14天全部动物处死，以每一创面为中心，切取1cmx 1cm正方形组织块(含兔耳全层)，并自创面正中对称二等分切开。标本迅速固定于中性福尔马林液，常规石蜡包埋、切片(厚度5μm)、HE染色。
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1.4 创面观察：观察各组创面肉芽组织生长情况。
1.5 组织学观测：创面横断面HE染色，镜下观察创缘新生肉芽组织增生情况，并以显微测微标尺精确测量上皮间距EG(Epithelial Gap)、肉芽组织间距GTG(Granulation Tissue Gap)及肉芽组织最大厚度PH(Peak Height)，从而得到反映创面愈合的三个重要指标：①新生上皮生长NEG(New EpithelialGrowth)=6mm-EG；②肉芽组织体积NGTV(NewGranularion Tissue Volume)=肉芽组织面积×PH，其中肉芽组织面积=[(6-GTG)/2]2×π；③肉芽组织最大厚度PH。
1.6 统计学处理：所得数据采用SPSS10.0统计软件对数据进行ANOVA和post-hoc检验，分析组间和两两差异，显著性差异标准a为0.05。
2 结果
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在术后3天，CW+VEGF组及NW组已见创缘有很少量肉芽形成及上皮爬行，色泽鲜红，在7天时生长已很明显。而CW组7天时尚未见明显肉芽组织形成。术后14天，CW组有少量肉芽及上皮化出现，而其它两组已有多量新生组织，颜色较3天及7天时稍淡，其中有3例创面完全愈合。
HE染色显示，14天时CW组表皮层完整，肉芽组织中大量炎细胞浸润，但成纤维细胞及新生血管管腔数量少；而CW+VEGF组新生表皮层较厚，表皮突明显，肉芽组织中大量的成纤维细胞聚集，微血管数量增多，仅散在少量炎细胞浸润。Nw组与CW+VEGF组差距不明显。这说明在肉芽组织生长期CW组肉芽增生缓慢，而其他两组肉芽增生活跃。
在术后14天，新生上皮生长NEG在三组之间两两比较均有统计学意义，P<0.05。Nw组最高，CW组最低，其中NW组较CW组增加249%，而CW+VEGF组较CW组增加了165%。肉芽组织厚度PH在三组间两两比较也有显著性差异，P<0.05。CW+VEGF组较CW组增加了70%，而NW组较CW组增加了46%。肉芽组织体积NGTV在CW+VEGF组及NW组无明显差异，但与CW组比较均有统计学意义，P<0.05。它们分别增加了317%、302%。以上结果表明：与非缺血创面相比，慢性创面的肉芽组织生长及上皮化速度明显下降；而转基因组全面提高了慢性创面的愈合指标数据，尤其对肉芽组织增生(PH)的促进作用较上皮化作用(NEG)更强。
3 讨论
近年来的大量研究表明，生长因子可以在一定程度上促进创面愈合，而血管内皮生长因子(VEGF)就是其中一类，又称血管渗透因子(VPF)，它是牛垂体星状细胞体外培养分离出的一种糖蛋白。根据VEGF mRNA的剪接方式不同，存在5种变异体，分别是：VEGF121、165、189、206、145，其中VEGF165是最多见的蛋白表达形式。它最主要的功能表现在两个方面：①它在体内体外都特异性地促进血管内皮细胞的增殖并诱导血管生成，是目前最强的促血管内皮细胞有丝分裂原：⑦它还可以增强微血管通透性，导致血浆蛋白广泛的外漏，其中包括纤维蛋白原、血浆酶原、纤维粘连蛋白等，这些, http://www.100md.com(彭 湃 韩 岩 杨 力 夏文森)