改良猪耳郭软骨细胞体外培养的实验研究
[摘要]目的：为组织工程化软骨修复机体软骨缺损提供实验基础。方法：用消化组织块培养法体外培养猪耳郭软骨细胞，并观察其在Polyglycol icacid(简称PGA)支架上的生长情况。结果：软骨细胞在pH值为7.0，含10%胎牛血清的DMEM培养液中生长良好，可传代1O代，细胞数目扩增为原来的400～500倍；软骨细胞在PGA支架上生长良好，分泌基质旺盛。结论：改良消化组织块方法培养软骨细胞是一种可以大量扩增软骨细胞数目的确实可行的方法，PGA是软骨细胞良好的生长支架。
[关键词]组织工程；软骨细胞；体外培养
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)05-0607-02
1 材料和方法
1.1 实验用品
, http://www.100md.com 1.1.1 实验器材：直径10cm的一次性塑料培养皿(德国生产)若干个，50ml一次性塑料离心管数支(美国生产)，细胞培养器材一套。
1.1.2 实验试剂：0.2%II型胶原酶(美国Sigma公司)、DMEM细胞培养基(杭州上城科创中心)、胎牛血清、0.25%的胰蛋白酶(美国Sigma公司)、PBS液、青霉素、链霉素、VitC、谷氨酰胺。
1.2 细胞培养液的制备：在DMEM加入Vitc 50mg、谷氨酰胺300mg，按1OOU/ml、100ug/ml分别加入青、链霉素，用前加入无菌胎牛血清，使其最终浓度为10%。调pH值为7.0左右，过滤消毒。
1.3 软骨组织的取材：小猪浸泡在75%酒精溶液中半小时后，在无菌操作下切下猪耳郭，仔细剥去皮肤和骨膜，用眼科剪将软骨组织剪成3mm左右的小方块，置于离心管中，加氯霉素冲洗液冲洗3次，再用PBS液冲洗3次。
, 百拇医药
1.4 软骨细胞的提取
1.4.1 消化：在上述盛软骨碎块的离心管中加入0.2%II型胶原酶，体积约为软骨体积的2倍，置于37℃的恒温振荡床中振荡、消化。
1.4.2 收集细胞：3～4h后第一次收集软骨细胞。将上述悬浊液倒入150目不锈钢滤筛滤去软骨组织，用于隔夜消化，第二天早上收集。过滤的液体2000r/min离心8min，轻轻吸除消化液，加入PBS液，漂洗1次，加入细胞培养液16ml，振荡混和制成细胞悬液。
1.4.3 计数、检查细胞活力
1.5 细胞培养方法
1.5.1 接种：每个培养皿加入8ml培养液(含10%的胎牛血清)，加入细胞悬液，每个培养皿接种2×106个细胞，轻微摇动培养皿，使细胞均匀的分布于培养皿中，置入37℃5%CO2温箱培养。
, http://www.100md.com
1.5.2 换液：培养第3天细胞已开始分裂生长，此时应更换培养液。具体方法是：用吸管吸去培养液后再加入等量新的培养液，置温箱继续培养。
1.5.3 传代：吸干培养液，用PBS液轻洗细胞1次，培养皿内加入0.25%的胰蛋白酶，以覆满皿底为限，置温箱2min后，显微镜下观察到细胞质已回缩，细胞间隙增大，即向培养皿里滴入2ml左右含血清的培养液终止消化，用套有软管的吸管轻轻刮下皿底细胞，使细胞彻底从培养皿底壁脱落，用吸管吸取混和液，制成细胞悬液，计数，观察细胞活力，按每个培养皿接种2×106个细胞，置入37℃ 5%CO2温箱培养。
1.5.4 将培养的l×108个软骨细胞接种在制备好的PGA支架上，置入37℃5%CO2温箱培养，观察软骨细胞的生长情况。
2 结果
, 百拇医药
2.1 软骨细胞生长情况：倒置显微镜下观察，刚分离出的软骨细胞呈圆形，有较强折光性，贴壁时间平均为10h，延伸时间为24h，4天左右形成单层细胞，细胞排列紧密，呈多角形。第一代传代后，软骨细胞贴壁时间平均为3h，延伸时间7h。第4天细胞已接近长满培养皿，此时进行传代。第二代传代细胞生长速度较快。随着代数的增加，细胞牛长速度越来越慢，细胞传代间隔的时间越来越长，连续培养至第10～11代，见细胞形态向成纤维细胞型转化，呈梭形，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴，增殖速度减慢，表明细胞已开始老化变性。此时收集到的细胞约为原来400～500倍。
2.2 软骨细胞接种在PGA支架上，可见呈膜片状，软骨细胞分泌基质旺盛，软骨细胞与基质粘附良好，中央不透明为大量细胞层叠，与支架粘附生长。
3 讨论
软骨组织结构致密，较难消化，消化酶的pH值、浓度及消化时间，对收集到的细胞的量及活力影响较大。另外，软骨细胞在培养、传代、扩增过程中对血清、培养皿以及传代的时机要求较为严格。
, http://www.100md.com
3.1 消化酶pH值、浓度及消化时间的确定消化酶的pH值制约着其活性，消化酶的浓度决定着组织消化时间的长短，过长会降低细胞的生命活力，甚至使细胞死亡，消化时间过短，又收集不到细胞。作者采用0.2%pH值为7.0的II型胶原酶，在37℃恒温振荡下，消化软骨组织，4h后第一次收集收集细胞，测得细胞活力为85%。过滤的软骨组织用消化过的II型胶原酶继续消化，隔夜第二次收集。这样比过去用0.15%II型胶原酶隔夜消化收集到质量好数目多的细胞。
3.2 血清的选择：血清中含有细胞增殖所需的生长因子和活性物质，培养液中血清的质量在很大程度上影响着细胞的生长。笔者采用了DMEM培养液后，细胞传代时间明显缩短，只需要4天，而以往采用F12培养液，则需要6天，说明DMEM培养液更适合软骨细胞的生长。
3.3 细胞传代时消化时机的把握：①消化酶的浓度、pH值及消化时间对细胞传代极为重要，浓度高则细胞反应快，掌握不好，细胞易死亡，浓度低和pH值不当时细胞消化慢，消化下来的细胞成片，不利计数。本实验采用pH值为7.0、浓度为0.25%的胰蛋白酶，在37℃温箱里消化2min，取得满意效果。②把握好传代时机，在80%～90%汇合阶段最合适，过早传代细胞产量少，过晚细胞密度太大而出现接触抑制和细胞毒性作用，细胞的健康状态不佳。
3.4 软骨细胞在体外培养中的特性：软骨细胞在体外经培养一段时间后，细胞易老化，丧失分泌基质的能力，从而难以从少量的软骨组织培养中获得大量的软骨细胞。笔者在实验中对传代方法的改进，不需要离心，有利于保护细胞，收到了很好的效果。软骨细胞可传到11代。
3.5 PGA是软骨细胞良好的粘附生长的支架，有利于软骨细胞分泌基质。而如何促进软骨细胞的生长，减慢软骨细胞衰老的速度，仍是组织工程化修复软骨缺损亟待解决的问题。
编辑 张惠娟
基金项目：汕头市科技局基金资助(编号：2004102), http://www.100md.com(王传家)
[关键词]组织工程；软骨细胞；体外培养
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)05-0607-02
1 材料和方法
1.1 实验用品
, http://www.100md.com 1.1.1 实验器材：直径10cm的一次性塑料培养皿(德国生产)若干个，50ml一次性塑料离心管数支(美国生产)，细胞培养器材一套。
1.1.2 实验试剂：0.2%II型胶原酶(美国Sigma公司)、DMEM细胞培养基(杭州上城科创中心)、胎牛血清、0.25%的胰蛋白酶(美国Sigma公司)、PBS液、青霉素、链霉素、VitC、谷氨酰胺。
1.2 细胞培养液的制备：在DMEM加入Vitc 50mg、谷氨酰胺300mg，按1OOU/ml、100ug/ml分别加入青、链霉素，用前加入无菌胎牛血清，使其最终浓度为10%。调pH值为7.0左右，过滤消毒。
1.3 软骨组织的取材：小猪浸泡在75%酒精溶液中半小时后，在无菌操作下切下猪耳郭，仔细剥去皮肤和骨膜，用眼科剪将软骨组织剪成3mm左右的小方块，置于离心管中，加氯霉素冲洗液冲洗3次，再用PBS液冲洗3次。
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1.4 软骨细胞的提取
1.4.1 消化：在上述盛软骨碎块的离心管中加入0.2%II型胶原酶，体积约为软骨体积的2倍，置于37℃的恒温振荡床中振荡、消化。
1.4.2 收集细胞：3～4h后第一次收集软骨细胞。将上述悬浊液倒入150目不锈钢滤筛滤去软骨组织，用于隔夜消化，第二天早上收集。过滤的液体2000r/min离心8min，轻轻吸除消化液，加入PBS液，漂洗1次，加入细胞培养液16ml，振荡混和制成细胞悬液。
1.4.3 计数、检查细胞活力
1.5 细胞培养方法
1.5.1 接种：每个培养皿加入8ml培养液(含10%的胎牛血清)，加入细胞悬液，每个培养皿接种2×106个细胞，轻微摇动培养皿，使细胞均匀的分布于培养皿中，置入37℃5%CO2温箱培养。
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1.5.2 换液：培养第3天细胞已开始分裂生长，此时应更换培养液。具体方法是：用吸管吸去培养液后再加入等量新的培养液，置温箱继续培养。
1.5.3 传代：吸干培养液，用PBS液轻洗细胞1次，培养皿内加入0.25%的胰蛋白酶，以覆满皿底为限，置温箱2min后，显微镜下观察到细胞质已回缩，细胞间隙增大，即向培养皿里滴入2ml左右含血清的培养液终止消化，用套有软管的吸管轻轻刮下皿底细胞，使细胞彻底从培养皿底壁脱落，用吸管吸取混和液，制成细胞悬液，计数，观察细胞活力，按每个培养皿接种2×106个细胞，置入37℃ 5%CO2温箱培养。
1.5.4 将培养的l×108个软骨细胞接种在制备好的PGA支架上，置入37℃5%CO2温箱培养，观察软骨细胞的生长情况。
2 结果
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2.1 软骨细胞生长情况：倒置显微镜下观察，刚分离出的软骨细胞呈圆形，有较强折光性，贴壁时间平均为10h，延伸时间为24h，4天左右形成单层细胞，细胞排列紧密，呈多角形。第一代传代后，软骨细胞贴壁时间平均为3h，延伸时间7h。第4天细胞已接近长满培养皿，此时进行传代。第二代传代细胞生长速度较快。随着代数的增加，细胞牛长速度越来越慢，细胞传代间隔的时间越来越长，连续培养至第10～11代，见细胞形态向成纤维细胞型转化，呈梭形，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴，增殖速度减慢，表明细胞已开始老化变性。此时收集到的细胞约为原来400～500倍。
2.2 软骨细胞接种在PGA支架上，可见呈膜片状，软骨细胞分泌基质旺盛，软骨细胞与基质粘附良好，中央不透明为大量细胞层叠，与支架粘附生长。
3 讨论
软骨组织结构致密，较难消化，消化酶的pH值、浓度及消化时间，对收集到的细胞的量及活力影响较大。另外，软骨细胞在培养、传代、扩增过程中对血清、培养皿以及传代的时机要求较为严格。
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3.1 消化酶pH值、浓度及消化时间的确定消化酶的pH值制约着其活性，消化酶的浓度决定着组织消化时间的长短，过长会降低细胞的生命活力，甚至使细胞死亡，消化时间过短，又收集不到细胞。作者采用0.2%pH值为7.0的II型胶原酶，在37℃恒温振荡下，消化软骨组织，4h后第一次收集收集细胞，测得细胞活力为85%。过滤的软骨组织用消化过的II型胶原酶继续消化，隔夜第二次收集。这样比过去用0.15%II型胶原酶隔夜消化收集到质量好数目多的细胞。
3.2 血清的选择：血清中含有细胞增殖所需的生长因子和活性物质，培养液中血清的质量在很大程度上影响着细胞的生长。笔者采用了DMEM培养液后，细胞传代时间明显缩短，只需要4天，而以往采用F12培养液，则需要6天，说明DMEM培养液更适合软骨细胞的生长。
3.3 细胞传代时消化时机的把握：①消化酶的浓度、pH值及消化时间对细胞传代极为重要，浓度高则细胞反应快，掌握不好，细胞易死亡，浓度低和pH值不当时细胞消化慢，消化下来的细胞成片，不利计数。本实验采用pH值为7.0、浓度为0.25%的胰蛋白酶，在37℃温箱里消化2min，取得满意效果。②把握好传代时机，在80%～90%汇合阶段最合适，过早传代细胞产量少，过晚细胞密度太大而出现接触抑制和细胞毒性作用，细胞的健康状态不佳。
3.4 软骨细胞在体外培养中的特性：软骨细胞在体外经培养一段时间后，细胞易老化，丧失分泌基质的能力，从而难以从少量的软骨组织培养中获得大量的软骨细胞。笔者在实验中对传代方法的改进，不需要离心，有利于保护细胞，收到了很好的效果。软骨细胞可传到11代。
3.5 PGA是软骨细胞良好的粘附生长的支架，有利于软骨细胞分泌基质。而如何促进软骨细胞的生长，减慢软骨细胞衰老的速度，仍是组织工程化修复软骨缺损亟待解决的问题。
编辑 张惠娟
基金项目：汕头市科技局基金资助(编号：2004102), http://www.100md.com(王传家)