Ad-METHk对培养的内皮细胞分泌活性的影响
[摘要]目的：研究基因重组血管抑制剂Ad-METHl(metalloprotease and thrombospondinl)对培养的内皮细胞分泌活性的影响，探讨血管生成抑制防治增生性瘢痕的可能机制。方法：制备重组血管抑制剂Ad-METHl，转染培养的人脐静脉内皮细胞，通过放射免疫分析法及酶联免疫分析法研究Ad-METHl对内皮细胞分泌内皮素-1(endothelin-1，ET-1)及碱性戍纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factot，bFGF)的影响。结果：基因转染后24h内皮细胞ET-1、bFGF分泌受到明显抑制。结论：Ad-METHl对内皮细胞ET-1、bFGF分泌活性有影响，此是其早期参与抑制增生性瘢痕形成的可能机制之一。
[关键词]基因转染；内皮细胞；内皮素-1；碱性成纤维细胞生长因子
[中图分类号]R619.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)06-0740-03
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近些年的研究显示，血管生成与瘢痕增生有着密切的关系。我们的研究也显示，基因重组血管抑制剂Ad-METHl可有效抑制兔耳增生性瘢痕的形成。内皮细胞作为主要的修复细胞在瘢痕组织血管生成及增生性瘢痕的形成中发挥着重要的作用，研究Ad-METHl对内皮细胞的生物学影响，对于揭示血管途径抑制增生性瘢痕的可能机制有着重要意义。
1 材料和方法
1.1 材料：DMEM培养基、胰蛋白酶(Gibeo)，MTT(Amresco美国)，胎牛血清(华美生物工程公司)，125I-ET放射免疫分析药盒(北京北免东雅生物技术研究所)，碱性成纤维细胞生长因子ELASA试剂盒(武汉博士德生物公司)；酶联免疫检测仪(DGS031，南京华东电子医疗公司)，Y计数仪(Capintce.inc美国)。
1.2 方法
1.2.1 重组血管抑制剂Ad-METHl的制备：利用基因重组技术，将高效血管抑制因子METHl克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV(strategenge公司)中，用限制性内切酶Pmel(Takara公司)酶切使之线性化，在大肠杆菌BJ5183(strategenge公司)内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(strategenge公司)同源重组，得到重组腺病毒载体pAdEasy-meth-1，用PacI(Takara公司)酶切线性化pAdEasy-meth-1，乙醇沉淀后，转染293细胞(ATCC公司)，在细胞内包装、重组，制备pAdEasy-methl重组腺病毒质粒。
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1.2.2 内皮细胞培养：取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC，由我校基础部生理学教研室马恒博士惠赠，为HUVEC细胞系)适量接种于DMEM培养基(10%胎牛血清，35.76mg/ml HEPES，青、链霉素各100U/m1)，在5%CO2的37℃孵箱中贴壁生长至70%～80%融合状态，加入0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2.3 检测Ad-METHl对内皮细胞分泌ET-1的影响：①取对数生长期的HUVEC，0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为5×104个/ml，100μl接种于96孔培养板中(实验组、对照组各10孔)，每孔5×103个细胞。将培养板置于含5%CO2、37℃、100%湿度的孵箱中培养，待细胞贴壁、伸展后实验组加入Ad-METHl，对照组加入空载腺病毒各10μl。将培养板在CO2孵箱中分别培养24h后吸取上清100μl待测。②加样：用碘-内皮素(FT)放射免疫分析药盒测实验组与对照组内皮细胞上清液中ET-1的含量。按试剂盒说明中所列程序表加样后充分混匀，室温放置15min，任取两管测量，作为总放射性强度T。3 500rpm(离心力1500g)离心20min，吸取上清液待测。③计数放射性活度：用16探头Y计数仪分别对加样处理后的标准管与样品管的放射性活度进行计数，测量时间1min。标准曲线由美国Capintce.inc提供的软件根据试剂盒中标准品浓度及其相对应的B/B0值自动生成，其中B/B0为纵坐标，标准品浓度为横坐标。数据处理时，根据待测样品B/B0值，在标准曲线上求出待测样品ET-1含量。
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1.2.4 检测Ad-METHl对内皮细胞分泌bFGF的影响：用碱性成纤维细胞生长因子ELISA试剂盒对培养上清中bFGF的浓度进行测定。实验按照试剂盒说明书所列步骤进行，加入TMB终止液显色后用酶标仪在450nm测定OD值，以TMB空白显色孔为对照。以吸光值为纵坐标，抗原浓度为横坐标，在坐标纸上绘制浓度一吸光值曲线。
2 结果
2.1 Ad-METHl对内皮细胞分泌ET-1的影响：根据待测样品B/BO值，利用标准曲线得出实验组与对照组待测样品ET-1浓度，求均值。实验组加入pAdEasy-methl后24h，培养上清液中ET-1浓度为(16.32±2.13)pg/m1(n=10)，对照组加入空载腺病毒后24h，培养上清液中ET-1浓度为(31.58±3.17)pg/ml(n=10)。采用SPSS10.0统计软件包对实验数据做t检验，两者问有统计学差异(P<0.05)，提示Ad-METHl对内皮细胞分泌ET-1的活性有明显的抑制作用。
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2.2 Ad-METHl对内皮细胞分泌bFGF的影响：根据不同浓度标准品所对应的吸光值，在坐标纸上绘制浓度一吸光值曲线，得出线性方程：Y＝-0.08734+0.01632X。根据待测样品的吸光值，利用此线性方程，求出对应bFGF浓度，求均值。实验组加入pAdEasy-methl后24h，培养上清液中bFGF浓度为(46.30±2.34)pg/ml(n=10)，对照组加入空载腺病毒后24h，培养上清液中bFGF浓度为(117.87±4.12)pg/ml(n=10)。经Origin 7.0对数据进行统计分析，两组间有统计学差异(P<0.05)，提示Ad-METHl对内皮细胞分泌bFGF的活性有明显的抑制作用。
3 讨论
增生性瘢痕是整形外科的常见病、多发病，目前临床缺乏有效的治疗手段。众多的研究显示，血管生成与瘢痕增生有着密切的关系，通过血管生成抑制可有效抑制增生性瘢痕的形成。受此提示我们将经过基因重组的血管抑制剂Ad-METHl应用于增生性瘢痕的防治研究，发现在瘢痕形成早期局部应用Ad-METHl后，瘢痕组织中血管生成、成纤维细胞增殖及胶原的合成受到了明显的抑制，提示Ad-METHl可能通过血管生成抑制途径对增生性瘢痕产生了重要的影响。
, 百拇医药
内皮细胞作为主要的修复细胞在瘢痕组织血管生成及增生性瘢痕的形成中发挥着重要的作用，激活的内皮细胞分泌的多种细胞因子，如VEGF、bFGF、ET-1等，对增生性瘢痕的形成产生了重要的影响，而内皮细胞过度增殖及凋亡受损对于增生性瘢痕的形成也起到了重要作用。为了进一步揭示血管生成抑制对增生性瘢痕的作用机制，我们研究了Ad-METHl对内皮细胞分泌活性影响，研究中，我们将Ad-METHl转染培养的内皮细胞，24h后培养上清中的ET-1、bFGF的浓度量明显降低，提示Ad-METHl抑制了内皮细胞对ET-1、bFGF的分泌。正常情况下，ET-1由内皮细胞分泌，真皮组织中有一定的表达，而ET-1在增生性瘢痕的微血管内皮细胞及成纤维细胞中呈高表达，有研究发现，ET-1是成纤维细胞的有丝分裂原，对瘢痕成纤维细胞DNA合成有明显促进作用，可通过ET受体介导促进成纤维细胞对Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成，并可降低胶原酶活性、抑制胶原的降解。bFGF是创伤修复早期参与血管生成的主要的因子，也是成纤维细胞的有丝分裂原，可直接作用于组织修复细胞周期(内皮细胞、成纤维细胞)，使细胞G1期比例下降，S期和G2+M期比例增加，细胞周期转换时间缩短，加速细胞的分裂与增殖，促进瘢痕组织成纤维细胞、内皮细胞的增殖及微血管的生成，研究显示，bFGF在增生性瘢痕组织中表达增强，它对增生性瘢痕形成的起到了一定的促进作用。
我们的研究结果提示Ad-METHl可能通过对内皮细胞ET-1、bFGF分泌的影响而抑制了增生性瘢痕的形成，对内皮细胞ET-1、bFGF分泌活性的影响是Ad-METHl抑制增生性瘢痕形成的可能机制之一。, http://www.100md.com(宋保强 鲁开化 郭树忠 张 阳 张琳西 王云雅)
[关键词]基因转染；内皮细胞；内皮素-1；碱性成纤维细胞生长因子
[中图分类号]R619.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)06-0740-03
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近些年的研究显示，血管生成与瘢痕增生有着密切的关系。我们的研究也显示，基因重组血管抑制剂Ad-METHl可有效抑制兔耳增生性瘢痕的形成。内皮细胞作为主要的修复细胞在瘢痕组织血管生成及增生性瘢痕的形成中发挥着重要的作用，研究Ad-METHl对内皮细胞的生物学影响，对于揭示血管途径抑制增生性瘢痕的可能机制有着重要意义。
1 材料和方法
1.1 材料：DMEM培养基、胰蛋白酶(Gibeo)，MTT(Amresco美国)，胎牛血清(华美生物工程公司)，125I-ET放射免疫分析药盒(北京北免东雅生物技术研究所)，碱性成纤维细胞生长因子ELASA试剂盒(武汉博士德生物公司)；酶联免疫检测仪(DGS031，南京华东电子医疗公司)，Y计数仪(Capintce.inc美国)。
1.2 方法
1.2.1 重组血管抑制剂Ad-METHl的制备：利用基因重组技术，将高效血管抑制因子METHl克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV(strategenge公司)中，用限制性内切酶Pmel(Takara公司)酶切使之线性化，在大肠杆菌BJ5183(strategenge公司)内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(strategenge公司)同源重组，得到重组腺病毒载体pAdEasy-meth-1，用PacI(Takara公司)酶切线性化pAdEasy-meth-1，乙醇沉淀后，转染293细胞(ATCC公司)，在细胞内包装、重组，制备pAdEasy-methl重组腺病毒质粒。
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1.2.2 内皮细胞培养：取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC，由我校基础部生理学教研室马恒博士惠赠，为HUVEC细胞系)适量接种于DMEM培养基(10%胎牛血清，35.76mg/ml HEPES，青、链霉素各100U/m1)，在5%CO2的37℃孵箱中贴壁生长至70%～80%融合状态，加入0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2.3 检测Ad-METHl对内皮细胞分泌ET-1的影响：①取对数生长期的HUVEC，0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为5×104个/ml，100μl接种于96孔培养板中(实验组、对照组各10孔)，每孔5×103个细胞。将培养板置于含5%CO2、37℃、100%湿度的孵箱中培养，待细胞贴壁、伸展后实验组加入Ad-METHl，对照组加入空载腺病毒各10μl。将培养板在CO2孵箱中分别培养24h后吸取上清100μl待测。②加样：用碘-内皮素(FT)放射免疫分析药盒测实验组与对照组内皮细胞上清液中ET-1的含量。按试剂盒说明中所列程序表加样后充分混匀，室温放置15min，任取两管测量，作为总放射性强度T。3 500rpm(离心力1500g)离心20min，吸取上清液待测。③计数放射性活度：用16探头Y计数仪分别对加样处理后的标准管与样品管的放射性活度进行计数，测量时间1min。标准曲线由美国Capintce.inc提供的软件根据试剂盒中标准品浓度及其相对应的B/B0值自动生成，其中B/B0为纵坐标，标准品浓度为横坐标。数据处理时，根据待测样品B/B0值，在标准曲线上求出待测样品ET-1含量。
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1.2.4 检测Ad-METHl对内皮细胞分泌bFGF的影响：用碱性成纤维细胞生长因子ELISA试剂盒对培养上清中bFGF的浓度进行测定。实验按照试剂盒说明书所列步骤进行，加入TMB终止液显色后用酶标仪在450nm测定OD值，以TMB空白显色孔为对照。以吸光值为纵坐标，抗原浓度为横坐标，在坐标纸上绘制浓度一吸光值曲线。
2 结果
2.1 Ad-METHl对内皮细胞分泌ET-1的影响：根据待测样品B/BO值，利用标准曲线得出实验组与对照组待测样品ET-1浓度，求均值。实验组加入pAdEasy-methl后24h，培养上清液中ET-1浓度为(16.32±2.13)pg/m1(n=10)，对照组加入空载腺病毒后24h，培养上清液中ET-1浓度为(31.58±3.17)pg/ml(n=10)。采用SPSS10.0统计软件包对实验数据做t检验，两者问有统计学差异(P<0.05)，提示Ad-METHl对内皮细胞分泌ET-1的活性有明显的抑制作用。
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2.2 Ad-METHl对内皮细胞分泌bFGF的影响：根据不同浓度标准品所对应的吸光值，在坐标纸上绘制浓度一吸光值曲线，得出线性方程：Y＝-0.08734+0.01632X。根据待测样品的吸光值，利用此线性方程，求出对应bFGF浓度，求均值。实验组加入pAdEasy-methl后24h，培养上清液中bFGF浓度为(46.30±2.34)pg/ml(n=10)，对照组加入空载腺病毒后24h，培养上清液中bFGF浓度为(117.87±4.12)pg/ml(n=10)。经Origin 7.0对数据进行统计分析，两组间有统计学差异(P<0.05)，提示Ad-METHl对内皮细胞分泌bFGF的活性有明显的抑制作用。
3 讨论
增生性瘢痕是整形外科的常见病、多发病，目前临床缺乏有效的治疗手段。众多的研究显示，血管生成与瘢痕增生有着密切的关系，通过血管生成抑制可有效抑制增生性瘢痕的形成。受此提示我们将经过基因重组的血管抑制剂Ad-METHl应用于增生性瘢痕的防治研究，发现在瘢痕形成早期局部应用Ad-METHl后，瘢痕组织中血管生成、成纤维细胞增殖及胶原的合成受到了明显的抑制，提示Ad-METHl可能通过血管生成抑制途径对增生性瘢痕产生了重要的影响。
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内皮细胞作为主要的修复细胞在瘢痕组织血管生成及增生性瘢痕的形成中发挥着重要的作用，激活的内皮细胞分泌的多种细胞因子，如VEGF、bFGF、ET-1等，对增生性瘢痕的形成产生了重要的影响，而内皮细胞过度增殖及凋亡受损对于增生性瘢痕的形成也起到了重要作用。为了进一步揭示血管生成抑制对增生性瘢痕的作用机制，我们研究了Ad-METHl对内皮细胞分泌活性影响，研究中，我们将Ad-METHl转染培养的内皮细胞，24h后培养上清中的ET-1、bFGF的浓度量明显降低，提示Ad-METHl抑制了内皮细胞对ET-1、bFGF的分泌。正常情况下，ET-1由内皮细胞分泌，真皮组织中有一定的表达，而ET-1在增生性瘢痕的微血管内皮细胞及成纤维细胞中呈高表达，有研究发现，ET-1是成纤维细胞的有丝分裂原，对瘢痕成纤维细胞DNA合成有明显促进作用，可通过ET受体介导促进成纤维细胞对Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成，并可降低胶原酶活性、抑制胶原的降解。bFGF是创伤修复早期参与血管生成的主要的因子，也是成纤维细胞的有丝分裂原，可直接作用于组织修复细胞周期(内皮细胞、成纤维细胞)，使细胞G1期比例下降，S期和G2+M期比例增加，细胞周期转换时间缩短，加速细胞的分裂与增殖，促进瘢痕组织成纤维细胞、内皮细胞的增殖及微血管的生成，研究显示，bFGF在增生性瘢痕组织中表达增强，它对增生性瘢痕形成的起到了一定的促进作用。
我们的研究结果提示Ad-METHl可能通过对内皮细胞ET-1、bFGF分泌的影响而抑制了增生性瘢痕的形成，对内皮细胞ET-1、bFGF分泌活性的影响是Ad-METHl抑制增生性瘢痕形成的可能机制之一。, http://www.100md.com(宋保强 鲁开化 郭树忠 张 阳 张琳西 王云雅)