电镜下观察面中份缝牵引成骨术对狗眶下神经的影响(2)
1.3 取材及电镜切片制备
1.3.1 取材:牵引第5、10、15天,固定第10、20天,去除牵引架后2月处死各组实验犬,对照犬最后也处死。用眼科剪去除双侧眼球,仔细分离出眶下裂中的眶下神经,在眶下孔近心端截取约长约2.0cm的神经。由于透射电镜对样品表面的要求非常严格,本实验是观察神经的横切面。所以取材及用生理盐水清洗标本时,注意保护神经观察面不受任何损伤,且保持干净,将神经横断面作为观察面进行标记,防止制作过程中分不清观察面所在的位置。 注意取神经标本时取材动作要快,一般要求在 2～3 min之内将组织浸入固定液内。 取材的器械、固定液要事先放在冰箱内预冷。
1.3.2 前固定:清洗的神经标本在清洗完毕后即刻投入2.5% 戊二醛固定液内进行固定。
1.3.3 漂洗:用0.1M磷酸缓冲液漂洗3次,每次15min。
, 百拇医药 1.3.4 后固定:1%锇酸固定液室温下固定1h左右。
1.3.5 脱水:利用不同浓度乙醇梯度脱水,由50%、70%、80%、90%、95%各15min,换醋酸异戊酯15min。
1.3.6 干燥:采用冷冻干燥法进行切片干燥。
1.3.7 镀膜:利用真空喷镀仪对神经标本观察表面进行镀膜,用金钯作为镀膜材料。
1.3.8 电镜下观察神经样本。
2结果
2.1大体观察同前期实验[5]。
2.2眶下神经电镜下各期形态结构变化
2.2.1 对照组:可见轴膜光滑、完整,轴浆中含有大量神经微管、微丝,以及少量小泡样结构,轴突内各成分排列有序、均匀。雪旺细胞胞核圆,界限清楚,胞质均匀、淡染,胞浆内可见散在线粒体、高尔基器及核蛋白体。在无髓神经纤维其胞浆直接包绕神经轴突,有髓神经纤维则由其胞质膜层层环绕轴突周围生成髓鞘。髓鞘层板明暗相间,层板间无分离,内层光滑连续,与轴膜以髓鞘内系膜相连,外层以外系膜与Schwann 细胞相连,横断面上呈同心圆环状。神经纤维间可见大量胶原纤维排列整齐,密度均匀,未见成纤维细胞及吞噬细胞(图1)。
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2.2.2 牵引第5天:可见部分有髓神经纤维髓鞘板层分离,其间有水肿液和崩解的碎片,部分髓鞘发生折叠起皱,轴索膜与髓鞘板层的最内侧分离,轴索与髓鞘之间出现空间,神经膜细胞部分发生变性,胞质中细胞器增多,其内可见崩解的髓鞘碎片;另外病变髓鞘周围可见吞噬细胞出现。间质中胶原纤维排列较紊乱(图2、3)。
1.2.3 牵引第10天:可见镜下所有有髓神经纤维髓鞘板层分离,轴索膜与髓鞘板层的最内侧分离,神经膜细胞胞质中细胞器增多,其内可见崩解的髓鞘碎片;但无髓神经纤维未见明显改变(图4)。
2.2.4 牵引第15天:可见髓鞘全层松散、破裂,轴索结构模糊,有髓神经纤维呈无均质状。神经膜细胞出现明显凹陷,胞浆内可见大量髓鞘残片及空泡,线粒体、高尔基器及粗面内质网和核蛋白体数量明显增多。细有髓神经纤维和无髓神经纤维病变较轻,粗有髓神经纤维变性明显。间质中可见巨噬细胞,部分区域胶原纤维排列较密集而紊乱(图5)。
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2.2.5 固定第10天:可见有髓神经纤维出现明显的修复性变化,脱髓鞘变神经纤维开始重新髓鞘化,髓鞘结构部分恢复,但所有髓鞘板层仍处于松解、破裂状态,髓鞘内可见明显的髓球形成。神经膜细胞增生,巨噬细胞功能活跃,胞质内含吞噬的髓鞘残片及大量溶酶体和细胞器(图6)。
2.2.6 固定第20天:神经纤维变性仍较明显,较固定第10天时有明显减轻,部分有髓神经纤维存在脱髓鞘变,但有小部分神经纤维髓鞘已经有所恢复,神经膜细胞仍处于增生状态,间质中胶原纤维排列仍处于紊乱状态(图7)。
2.2.7去除牵引架2月:有髓神经纤维除少量髓鞘仍可见髓球及髓鞘松散现象外,大部分已经恢复正常,神经束膜细胞形态基本恢复正常,间质中胶原纤维排列无明显紊乱,细有髓神经纤维和无髓神经纤维恢复正常(图8)。
3讨论
面中份缝牵引是矫正颅颌面畸形的一种新技术,它是利用外来的机械牵张力牵拉正处于发育期的上颌复合体的骨缝组织,诱发上颌缝,诸如腭横缝、前颌缝、颧颌缝、颧颞缝、翼上颌缝的扩张分离与新骨的形成,使上颌复合体前移,从而来矫正面中部发育不足[6]。目前,随着这种技术的逐步推广应用,其本身存在的一些问题也开始引起人们的重视,如其是否会对上颌骨周围的组织器官如眶下神经、腭大神经、颞下颌关节、口颌系统的形态和功能产生不良影响,目前尚未有明确和统一的认识。
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本实验首先在以往研究[3-4]的基础上,对其原用的牵引犬面中份骨的牵引装置进行了改进:外牵引装置材料由锻造铁丝改为铝合金,牵引钩改为牵引杆,把经鼻腭孔牵引改为克氏针穿颊牵引。这样,无论是牵引装置的稳固性,还是牵引方向的可控性,都较先前有了很大提高。然后通过动态观察牵引期3个时间段、固定期2个时间段以及去固定2月后眶下神经在电镜下形态结构的变化,了解面中份缝牵引成骨对眶下神经的影响。
目前许多研究表明,机械牵拉力对神经会造成明显损伤,神经对损伤的敏感性与其解剖位置及其对牵拉的耐受力,与牵引距离、牵引速度有密切关系。Ross[7]认为神经纤维纵向呈“波浪状”排列, 这赋予神经一定的延长潜力,但是这种潜力是有一定限度的,超过这个限度, 就会造成神经纤维的损伤。Lee 等[8]和Strong 等[9]的动物实验显示,四肢骨牵引过程中神经受牵拉可导致髓磷脂分解形成小病灶及异常髓鞘再生。Polo 等[10]发现,腓骨牵引成骨早期可对周围神经功能产生影响,腓神经几乎全部被破坏,推测是由直接机械张力引起,但后期均有良好恢复。Li等[11]认为, 在一定范围内, 增加牵引速度可以更强地刺激骨膜成骨,但过快的牵引速度,例如2.0mm/天,会对下牙槽神经造成严重的损伤。蒋朝华等[12]研究较大速率牵引羊下颌骨观察对下牙槽神经的影响发现,按1.5mm/天,3次/天进行牵引,只是在牵引完成初期下牙槽神经出现广泛的Waller变性, 后期无神经纤维化改变,其认为下牙槽神经退行性变是可逆的。李刚等[13]对兔下颌骨以1.5mm/天和1.0mm/天变速牵引15mm 后, 发现下牙槽神经受到明显的影响,到15周时,下牙槽神经的功能有恢复的趋势。
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眶下神经是三叉神经的上颌神经的分支,属于感觉神经,其位于骨性眶下裂内,在眶下裂内发出上牙槽前、中神经,出眶下孔发出面支分布于眶下区皮肤。在实验中我们发现:随着上颌复合体前移,在整个牵引期内,眶下神经的形态结构出现渐进性的损伤性变化:光镜下观察神经的纵切面可见神经纤维曲度逐渐消失、断裂、崩解,髓鞘肿胀、模糊不清,轴突连续性发生中断,雪旺细胞增殖、发生空泡变[5];本实验电镜下观察神经的横断面则可见粗的有髓神经纤维出现髓鞘板层由分离到最后的崩解,轴索的结构逐渐消失,雪旺细胞的增生及其内容物的增多,神经间质中出现巨噬细胞及胶原纤维排列紊乱等现象,但细的有髓神经及无髓神经纤维病变轻微。推测其原因可能是快速的机械性牵张力导致眶下神经在单位时间内承受较大的纵向张应力,而且随着神经干的快速延伸,神经束横断面积急剧减少,束间横向压力升高,结果导致神经束内血管闭塞,血液循环障碍而发生沃勒变性;另一方面可能是由于面中份骨牵引延长过程中产生的持续牵引力的速度超过了神经自身的生长速度,使其组织结构产生了一定的损伤性变化。当牵引完成进入固定期后,我们发现,随着固定时间的延长以及去除牵引装置后,神经损伤和变性反应逐渐减轻:光镜下可见神经纤维逐渐恢复其曲度,排列也较为有序,其间的黏液减少,髓鞘肿胀逐渐减轻,空泡变性的雪旺细胞较少[5];电镜下可见随着时间的推移,由于神经组织自身的修复性、适应性变化,牵引力造成的神经损伤和变性反应逐渐减轻,到固定期,神经纤维基本恢复正常排列,纤维间粘液变减少,轴突大部分恢复连续性,髓鞘肿胀减轻,脱髓鞘变神经纤维开始重新髓鞘化,空泡变性的雪旺细胞明显减少[5];电镜下可见有髓神经纤维重新髓鞘化,神经束膜细胞、吞噬细胞大量增生,受损的神经纤维出现了明显的再生,间质中胶原纤维紊乱减轻。这说明适当的牵引力、牵引速度、牵引距离(800g前牵引力牵引犬面中份骨15天,牵引速度平均0.97～0.98mm/天),不会对眶下神经造成不可逆的损伤。去除牵引架2月后神经纤维基本恢复正常。, 百拇医药(金增强 董忠生 马 骁 柳春明)
1.3.1 取材:牵引第5、10、15天,固定第10、20天,去除牵引架后2月处死各组实验犬,对照犬最后也处死。用眼科剪去除双侧眼球,仔细分离出眶下裂中的眶下神经,在眶下孔近心端截取约长约2.0cm的神经。由于透射电镜对样品表面的要求非常严格,本实验是观察神经的横切面。所以取材及用生理盐水清洗标本时,注意保护神经观察面不受任何损伤,且保持干净,将神经横断面作为观察面进行标记,防止制作过程中分不清观察面所在的位置。 注意取神经标本时取材动作要快,一般要求在 2～3 min之内将组织浸入固定液内。 取材的器械、固定液要事先放在冰箱内预冷。
1.3.2 前固定:清洗的神经标本在清洗完毕后即刻投入2.5% 戊二醛固定液内进行固定。
1.3.3 漂洗:用0.1M磷酸缓冲液漂洗3次,每次15min。
, 百拇医药 1.3.4 后固定:1%锇酸固定液室温下固定1h左右。
1.3.5 脱水:利用不同浓度乙醇梯度脱水,由50%、70%、80%、90%、95%各15min,换醋酸异戊酯15min。
1.3.6 干燥:采用冷冻干燥法进行切片干燥。
1.3.7 镀膜:利用真空喷镀仪对神经标本观察表面进行镀膜,用金钯作为镀膜材料。
1.3.8 电镜下观察神经样本。
2结果
2.1大体观察同前期实验[5]。
2.2眶下神经电镜下各期形态结构变化
2.2.1 对照组:可见轴膜光滑、完整,轴浆中含有大量神经微管、微丝,以及少量小泡样结构,轴突内各成分排列有序、均匀。雪旺细胞胞核圆,界限清楚,胞质均匀、淡染,胞浆内可见散在线粒体、高尔基器及核蛋白体。在无髓神经纤维其胞浆直接包绕神经轴突,有髓神经纤维则由其胞质膜层层环绕轴突周围生成髓鞘。髓鞘层板明暗相间,层板间无分离,内层光滑连续,与轴膜以髓鞘内系膜相连,外层以外系膜与Schwann 细胞相连,横断面上呈同心圆环状。神经纤维间可见大量胶原纤维排列整齐,密度均匀,未见成纤维细胞及吞噬细胞(图1)。
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2.2.2 牵引第5天:可见部分有髓神经纤维髓鞘板层分离,其间有水肿液和崩解的碎片,部分髓鞘发生折叠起皱,轴索膜与髓鞘板层的最内侧分离,轴索与髓鞘之间出现空间,神经膜细胞部分发生变性,胞质中细胞器增多,其内可见崩解的髓鞘碎片;另外病变髓鞘周围可见吞噬细胞出现。间质中胶原纤维排列较紊乱(图2、3)。
1.2.3 牵引第10天:可见镜下所有有髓神经纤维髓鞘板层分离,轴索膜与髓鞘板层的最内侧分离,神经膜细胞胞质中细胞器增多,其内可见崩解的髓鞘碎片;但无髓神经纤维未见明显改变(图4)。
2.2.4 牵引第15天:可见髓鞘全层松散、破裂,轴索结构模糊,有髓神经纤维呈无均质状。神经膜细胞出现明显凹陷,胞浆内可见大量髓鞘残片及空泡,线粒体、高尔基器及粗面内质网和核蛋白体数量明显增多。细有髓神经纤维和无髓神经纤维病变较轻,粗有髓神经纤维变性明显。间质中可见巨噬细胞,部分区域胶原纤维排列较密集而紊乱(图5)。
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2.2.5 固定第10天:可见有髓神经纤维出现明显的修复性变化,脱髓鞘变神经纤维开始重新髓鞘化,髓鞘结构部分恢复,但所有髓鞘板层仍处于松解、破裂状态,髓鞘内可见明显的髓球形成。神经膜细胞增生,巨噬细胞功能活跃,胞质内含吞噬的髓鞘残片及大量溶酶体和细胞器(图6)。
2.2.6 固定第20天:神经纤维变性仍较明显,较固定第10天时有明显减轻,部分有髓神经纤维存在脱髓鞘变,但有小部分神经纤维髓鞘已经有所恢复,神经膜细胞仍处于增生状态,间质中胶原纤维排列仍处于紊乱状态(图7)。
2.2.7去除牵引架2月:有髓神经纤维除少量髓鞘仍可见髓球及髓鞘松散现象外,大部分已经恢复正常,神经束膜细胞形态基本恢复正常,间质中胶原纤维排列无明显紊乱,细有髓神经纤维和无髓神经纤维恢复正常(图8)。
3讨论
面中份缝牵引是矫正颅颌面畸形的一种新技术,它是利用外来的机械牵张力牵拉正处于发育期的上颌复合体的骨缝组织,诱发上颌缝,诸如腭横缝、前颌缝、颧颌缝、颧颞缝、翼上颌缝的扩张分离与新骨的形成,使上颌复合体前移,从而来矫正面中部发育不足[6]。目前,随着这种技术的逐步推广应用,其本身存在的一些问题也开始引起人们的重视,如其是否会对上颌骨周围的组织器官如眶下神经、腭大神经、颞下颌关节、口颌系统的形态和功能产生不良影响,目前尚未有明确和统一的认识。
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本实验首先在以往研究[3-4]的基础上,对其原用的牵引犬面中份骨的牵引装置进行了改进:外牵引装置材料由锻造铁丝改为铝合金,牵引钩改为牵引杆,把经鼻腭孔牵引改为克氏针穿颊牵引。这样,无论是牵引装置的稳固性,还是牵引方向的可控性,都较先前有了很大提高。然后通过动态观察牵引期3个时间段、固定期2个时间段以及去固定2月后眶下神经在电镜下形态结构的变化,了解面中份缝牵引成骨对眶下神经的影响。
目前许多研究表明,机械牵拉力对神经会造成明显损伤,神经对损伤的敏感性与其解剖位置及其对牵拉的耐受力,与牵引距离、牵引速度有密切关系。Ross[7]认为神经纤维纵向呈“波浪状”排列, 这赋予神经一定的延长潜力,但是这种潜力是有一定限度的,超过这个限度, 就会造成神经纤维的损伤。Lee 等[8]和Strong 等[9]的动物实验显示,四肢骨牵引过程中神经受牵拉可导致髓磷脂分解形成小病灶及异常髓鞘再生。Polo 等[10]发现,腓骨牵引成骨早期可对周围神经功能产生影响,腓神经几乎全部被破坏,推测是由直接机械张力引起,但后期均有良好恢复。Li等[11]认为, 在一定范围内, 增加牵引速度可以更强地刺激骨膜成骨,但过快的牵引速度,例如2.0mm/天,会对下牙槽神经造成严重的损伤。蒋朝华等[12]研究较大速率牵引羊下颌骨观察对下牙槽神经的影响发现,按1.5mm/天,3次/天进行牵引,只是在牵引完成初期下牙槽神经出现广泛的Waller变性, 后期无神经纤维化改变,其认为下牙槽神经退行性变是可逆的。李刚等[13]对兔下颌骨以1.5mm/天和1.0mm/天变速牵引15mm 后, 发现下牙槽神经受到明显的影响,到15周时,下牙槽神经的功能有恢复的趋势。
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眶下神经是三叉神经的上颌神经的分支,属于感觉神经,其位于骨性眶下裂内,在眶下裂内发出上牙槽前、中神经,出眶下孔发出面支分布于眶下区皮肤。在实验中我们发现:随着上颌复合体前移,在整个牵引期内,眶下神经的形态结构出现渐进性的损伤性变化:光镜下观察神经的纵切面可见神经纤维曲度逐渐消失、断裂、崩解,髓鞘肿胀、模糊不清,轴突连续性发生中断,雪旺细胞增殖、发生空泡变[5];本实验电镜下观察神经的横断面则可见粗的有髓神经纤维出现髓鞘板层由分离到最后的崩解,轴索的结构逐渐消失,雪旺细胞的增生及其内容物的增多,神经间质中出现巨噬细胞及胶原纤维排列紊乱等现象,但细的有髓神经及无髓神经纤维病变轻微。推测其原因可能是快速的机械性牵张力导致眶下神经在单位时间内承受较大的纵向张应力,而且随着神经干的快速延伸,神经束横断面积急剧减少,束间横向压力升高,结果导致神经束内血管闭塞,血液循环障碍而发生沃勒变性;另一方面可能是由于面中份骨牵引延长过程中产生的持续牵引力的速度超过了神经自身的生长速度,使其组织结构产生了一定的损伤性变化。当牵引完成进入固定期后,我们发现,随着固定时间的延长以及去除牵引装置后,神经损伤和变性反应逐渐减轻:光镜下可见神经纤维逐渐恢复其曲度,排列也较为有序,其间的黏液减少,髓鞘肿胀逐渐减轻,空泡变性的雪旺细胞较少[5];电镜下可见随着时间的推移,由于神经组织自身的修复性、适应性变化,牵引力造成的神经损伤和变性反应逐渐减轻,到固定期,神经纤维基本恢复正常排列,纤维间粘液变减少,轴突大部分恢复连续性,髓鞘肿胀减轻,脱髓鞘变神经纤维开始重新髓鞘化,空泡变性的雪旺细胞明显减少[5];电镜下可见有髓神经纤维重新髓鞘化,神经束膜细胞、吞噬细胞大量增生,受损的神经纤维出现了明显的再生,间质中胶原纤维紊乱减轻。这说明适当的牵引力、牵引速度、牵引距离(800g前牵引力牵引犬面中份骨15天,牵引速度平均0.97～0.98mm/天),不会对眶下神经造成不可逆的损伤。去除牵引架2月后神经纤维基本恢复正常。, 百拇医药(金增强 董忠生 马 骁 柳春明)