1.4 骨髓间充质干细胞的5-BrdU标记:选用第3～4代细胞,细胞移植前48h,以含终浓度为10μmol/L的5-BrdU进行标记;2天后,0.25%胰酶室温下消化、1 500r/min离心5min,PBS洗涤、收集细胞。

    1.5 动物模型的建立和骨髓间充质干细胞的输注:取SD雄性大鼠6只,适应性喂养2周后,禁食12h,按65mg/kg体质量剂量一次性腹腔内注射链脲佐菌素(溶于0.1mmol/L柠檬酸缓冲液,pH4.4);48h后,连续三次裁尾取血,用欧姆龙血糖试纸测试大鼠的血糖值均≥16.7mmol/L,糖尿病大鼠模型诱导成功;同时用0.3%戊巴比妥钠按10ml/kg体质量剂量作大鼠腹腔注射麻醉[2];待麻醉成功后,在大鼠背部制作半径为0.8cm的圆形创面,取密度为1.0×106/ml 5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞1ml,均匀注射于大鼠创面边缘;分别于注射后2、3周切取创面中央再生组织块,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,2μm连续切片,备用。

    1.6 免疫组织化学染色:连续切片采用SP法进行免疫组织化学染色,严格按照美国ZYMED公司提供的免疫组织化学试剂盒说明书操作,DAB显色剂显色。兔抗Brdu单克隆抗体工作浓度1:100;小鼠抗广谱细胞角蛋白单克隆抗体工作浓度1:50。以非特异血清代替一抗作为阴性对照,以细胞核呈深棕色着色为BrdU阳性细胞,角蛋白阳性细胞胞浆呈棕黄色 ......