TGF-β1影响人牙周膜成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶-1的初步研究(2)
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1.2.2各实验组及对照组细胞上清样本收集:根据所购生物因子TGF-β1说明书指示,设立TGF-β1工作浓度梯度:0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.07ng/ml、0.09ng/ml,即为4个实验组;采用0ng/ml TGF-β1为对照组。取传代至第5代HPDLFs,消化重悬,接种于小方瓶中。将加有上述各浓度TGF-β1 10%胎牛血清αMEM培养液分别加至小方瓶,每瓶4ml,放入37℃、5%CO2孵箱培养。分别于细胞培养至4h、8h、12h、24h、48h各时间点收获上清液,每组取200μl,后立即置入-20℃低温冰箱冻存。
1.2.3双抗体夹心ABC-ELISA法检测MMP-1含量:通过双抗体夹心ABC-ELISA法检测各样本上清中MMP-1含量。根据试剂盒说明书指示:抗人MMP-1单抗已包被于酶标板上(48孔 预包被);将ELISA检测试剂盒中的标准品分别加入酶标板第1、2列;第2列为复本,以求减小误差;通过倍比稀释标准品建立标准曲线 (孔H1、H2为空白对照)。
将各实验组、对照组样本上清液按布孔设计依次添加至酶标板各孔,37℃孵育120min,洗板,滤干;加入一抗工作液,每孔50μl,37℃孵育60min,洗板,滤干;加入酶标抗体工作液,每孔100μl,37℃孵育60min,洗板,滤干;每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应7min;肉眼观察酶标板已有显色反应,每孔加入50μl终止夜终止反应;在492nm处测吸光值。以上各步骤均严格遵照检测试剂盒说明书操作。
1.2.4数据处理:使用SPSS12.0统计软件包,将所测得MMP-1含量用多元线性回归方法进行统计分析。
2结果
2.1 HPDLFs原代培养情况:原代培养细胞从组织块中爬出时间为10～14天。镜下观察见:细胞以组织块为中心,呈放射状排列生长,局部形成生长晕,细胞呈长梭形或多突起星形,胞突细长,胞体丰满,胞质均匀,核圆形或卵圆形,核仁清晰 ......
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