ADSC-bFGF对大鼠腹壁成形术后TRAM皮瓣活性的影响(2)
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1材料
1.1 设计:采取随机,对照,动物实验。
1.2 时间及地点:于2010-04至2010-07在哈尔滨医科大学动物实验室完成。
1.3 实验材料:健康纯种成年雄性SD大鼠,质量为250～280g(哈尔滨医科大学动物实验中心提供),共28只。DMEM-F12培养基(美国Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青公司,中国),CD31单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),PV-6000通用型二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司),纤维蛋白凝胶(上海利康瑞生物工程有限公司),贝复济(珠海亿胜生物制药有限公司)。
2方法
2.1 脂肪来源间充质干细胞(Adipose derived stromal cell ,ADSC)的体外分离、纯化、扩增培养:取250～280g的雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧腹股沟脂肪垫,剪碎脂肪。0.075%Ⅰ型胶原酶消化1h,用含血清的DMEM-F12培养液终止消化,1500 r/min,离心10min,用含有10%胎牛血清的DMEM重悬。按3×105/cm2的细胞密度接种于25cm2塑料培养瓶,置于37℃,5%C02饱和湿度的孵箱内培养。72 h更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每3天换液1次。通过反复传代可得到纯化的ADSC(图1)。
2.2 实验分组及治疗:实验动物随机分为4组,每组7只。①A组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(ADSC+ bFGF);②B组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(ADSC);③C组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(纤维蛋白凝胶);④D组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(生理盐水)
2.3 动物模型构建
2.3.1 腹壁成形术模型及治疗:健康纯种成年雄性SD大鼠,250～280g。水合氯醛(10%)腹腔注射麻醉(0.3ml/100g),麻醉完毕,将SD大鼠采取仰卧位固定在大鼠板上。
腹壁成形术的切口设计线呈倒梯形状。先描画出剑突的位置,在鼠尾方向离剑突1cm的位置设计出与腹正中线垂直的5cm上底线。向下0.5cm再设计出与该线平行的水平线。尾部方向的基底线长2cm,距上底线3cm(图2A)。0.5%碘伏消毒大鼠腹部术区,铺无菌洞巾。沿切口线切开大鼠皮肤、皮下至深筋膜层,沿头尾方向在深筋膜层掀起皮瓣,离断进入皮肤的穿支。标出两侧腹直肌腱膜,其大小为3cm×0.5cm,距腹正中线0.25cm。对A、B、C、D四组分别用ADSC-bFGF悬液(细胞为第四代)、ADSC细胞悬液(第四代)、纤维蛋白凝胶和生理盐水,分四点注射到腹直肌上(图2B)。每点均为0.1ml,总量为0.4ml/只。然后将0.5cm×5cm的皮条切除。缝合切口。实验完毕后单笼饲养,麻醉清醒后,自由供应饮食饮水。每日观察大鼠的生活状态。
2.3.2 TRAM模型建立:腹壁成形术后1个月,所有实验动物均构建TRAM模型。
TRAM皮瓣位于剑突下1cm,大小为10.5cm2。沿设计线切开皮肤后,将皮瓣从左侧的蒂部向腹白线分离。将右侧的皮瓣从外侧缘向腹直肌分离。沿腹白线和腹直肌外测沿作纵切口,将头侧的腹直肌切断,制作成以右侧腹直肌为蒂,腹壁下动脉供血的皮瓣(图3)。
2.4 皮瓣坏死的鉴定:在TRAM皮瓣术后7天进行皮瓣坏死面积的评估(图4)。术后7天水合氯醛10ml/kg腹腔注射处死动物。即刻切取全部腹壁组织(包括腹直肌),用硫酸纸描绘皮瓣成活区域范围并扫描入计算机。应用Adobe Photoshop CS2软件测量皮瓣成活面积,以成活面积/设计面积的比值表示皮瓣成活情况。
2.5 组织标本取材:根据Lineaweaver等[3]的方法,将TRAM皮瓣分为四个区:Ⅰ区,腹中线到右侧腹直肌外侧缘间的区域;Ⅱ区,腹中线到左侧腹直肌外侧缘间的区域;Ⅲ区,右侧腹直肌外侧缘到右侧皮瓣边缘的区域;Ⅳ区,左侧腹直肌外侧缘到左侧皮瓣边缘的区域。无菌条件下切取大鼠皮瓣小块约0.5cm×0.5cm大小组织,分别取距皮瓣各区中间的组织。用4%甲醛固定24h后制成石蜡病理切片;一部分切片用于苏木素-伊红染色,观察组织病变情况;另一部分则用于免疫组化检测。
2.6 微血管密度(microvessel density,MVD)检测:标本石蜡切片后HE染色,40倍光学显微镜在皮下组织中随机取6个视野计算微血管数取平均值,根据每个视野0.1885mm2换算成每mm2血管数做统计学处理。
2.7 统计学处理:用SPSS 13.0软件进行统计学处理,数据采用各组的平均值±标准误表示,各组间比较采用t检验,P<0.05差异有统计学意义。
3结果
3.1 皮瓣活性:皮瓣模型建立1周后,观察大鼠腹部皮瓣。大鼠皮瓣Ⅰ区的全部、II区及Ⅲ区的小部份存活。A组基本存活,创面干燥。而其他三组存在不同程度的坏死现象。图片经图像分析系统计算出A,B,C,D四组的存活面积百分比分别是(69.40±2.81 )%、(66.19±2.32)%、(46.69±2.41) %和(43.77±3.55)%。统计学分析皮瓣成活率A组与B组差异有意义(P<0.05 ),且这两组明显高于C组及D组,差异有显著性意义(P<0.01)。C组与D组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1,2)。
3.2 HE染色分析:术后第7天,切取的皮瓣组织病理切片,HE染色可见,A、B两组表皮完整有轻度萎缩,组织内轻度炎症浸润,有较高密度的小血管分布,内有红细胞充盈,纤维组织细胞增生明显。C、D两组皮瓣萎缩明显,皮下组织有水肿,炎细胞浸润明显,新生血管数目较少,皮下纤维增生,排列不规则 (图5)。
3.3 微血管密度(MVD)测量:各组动物术后第7天皮瓣内MVD:(65.30±2.19)根/mm2;(59.99±2.41)根/mm2;(44.71±2.21)根/mm2;(42.44±3.22)根/mm2。皮瓣微血管密度A组与B组差异有显著性意义(P<0.01);A、B两组明显高于C组(P<0.01)及D组(P<0.01),差异有显著性意义;C组与D组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3、4)。
3.4 免疫组化结果:注射ADSC-bFGF组组织内血管内皮CD31呈阳性表达,染色的血管内皮标记出微血管,血管内皮细胞浆内褐色抗原抗体复合物沉积,甚至可见抗原抗体复合物呈带状围绕血管腔,而生理盐水组不明显(图6)。
4讨论
大鼠腹部血管结构同人体相似,大鼠TRAM皮瓣模型已证实是可靠的实验动物模型。我们采用了de Freitas等[4]提出的腹壁成形术后TRAM皮瓣模型,选择以腹壁下动脉为供应血管,右侧低位带蒂的TRAM皮瓣。尽管其在大鼠上并不是最理想的动物模型,但它更贴近于人的TRAM皮瓣 ......
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