I型IP3受体在自体中厚移植皮片中的表达(2)
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参见附件(2642KB，3页)。
1.2 主要试剂：I型IP3受体抗体(Santa Cruz 公司，美国)；SP免疫组化染色试剂盒，DAB 试剂盒(Sigma 公司，美国)等。
1.3 免疫组化步骤：皮肤标本经固定、脱水、石蜡包埋后。切成4mm石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的载玻片上。6O℃烤4～8h。将石蜡切片脱蜡至水，0.3%H2O2室温20min,PBS洗3次，加入0.01mmol/L，pH 6.0柠檬酸盐缓冲液，微波处理2次(每次10min)，修复抗原，冷却后PBS洗2次。加I型IP3受体抗体1:100稀释，4℃孵育过夜，彻底水洗，加入1:200生物素化兔抗鼠IgG，室温30min，加1:400 StrepAvidin-HRP，室温30min。以上各步骤均经0.01mmol/L PBS(pH7.4)冲洗3min，3次；然后将切片置0.05% DAB+0.03%H2O2显色液中显色8～12min；蒸馏水，冲洗，苏木素复染1min；脱水，透明，中性树胶封片。全部标本用PBS做空白对照。
1.4 观察与结果判定：按照吕宏升[4]等提出的免疫组化定量分析图像采集方法要求，设定好参数，所有切片的照相工作均一次完成，采用专业图像分析软件Image-Pro Plus 6.0测得切片上DAB显色为棕黄色代表阳性区域的光密度值，每张切片分别随机选取10个视野，测量光密度，取其平均值作为平均光密度值，并将以此代表实验所研究蛋白的表达强度进行分析。
1.5 统计学处理：采用SPSS11.5 统计软件包进行分析。实验组与两正常对照组的光密度值均以(x±s)表示。组间行配对t检验。
2结果
I型IP3受体主要位于黑素细胞、角质形成细胞胞浆，胞核亦有部分表达，呈黄色、棕黄色或棕褐色颗粒或团块，呈局灶性或弥漫性分布，苏木素复染胞核呈蓝色，背景清晰。在大部分自体中厚移植皮片中呈强阳性表达。在表皮基底层处形成棕褐色条带(图1)。I型IP3受体在自体移植中厚皮片实验组中表达的平均光密度值为0.47±0.07。在受区周围正常对照皮肤对照组中表达的平均光密度值为0.21±0.09。在原供区周围正常皮肤对照组中表达的平均光密度值为0.19±0.08。I型IP3受体在实验组中的表达与在两对照组正常对照皮肤中的表达差异有统计学意义(P<0.05)，在两对照组间的表达差异无统计学意义(图2)。
3讨论
自体皮片移植是整形外科中常用的手术方法，但因皮片移植后常伴有不同程度的过度色素沉着而限制了其临床应用范围，目前对于引起这一现象的发生机制尚未完全阐明。有研究表明自体皮片移植过程中，多种因素的作用致皮片中α-MSH的表达增加，继而激活其特异性受体MC-1R，使黑素细胞内酪氨酸酶的表达增加、活性增强，促进黑素合成、分泌增加[5]，有研究亦表明α-MSH前体的合成[6]、酪氨酸酶的激活[7]等都需要钙信号的参与。本课题组前期研究也发现在自体移植皮片中钙调蛋白的表达明显增加，表明钙信号传导的增强参与调控了皮片过度色素沉着过程。而细胞内钙信号的产生有细胞外Ca2+进入细胞质和胞内钙库Ca2+释放至细胞质两种途径[8]，而胞内钙库钙离子释放主要受IP3受体调控，故进一步了解皮片中IP3受体的表达情况有助于理解皮片中钙信号增强产生的途径和机制。
IP3受体广泛分布于各组织细胞，至少有3种亚型：IP3R1，IP3R2和IP3R3，这3种亚型的氨基酸序列具有60%～70%的同源性，其中I型IP3受体分布于粗面内质网和外层核模[9-10]，释放Ca2+能力最强[11]。IP3受体引起的Ca2+释放具有以下几个方面的特点：①双相性：前期是快速释放阶段，随之为慢速阶段。前者的释放速度与IP3的浓度成比例，而后者即使在恒定浓度的IP3下也非常缓慢；②双激活剂：IP3受体通道的开放既受IP3的激活，也受Ca2+的激活。但Ca2+对通道开放的激活作用与Ca2+本身的浓度有关，在无IP3存在的情况下，低浓度(200～300 nmol/L)时通道激活，而高浓度抑制[12]；③负反馈：Taylor等[13]报道Ca2+与钙调蛋白CaM结合可抑制IP3与受体结合，机制可能是CaM与IP3受体和Ca2+结合的部位相同，从而抑制IP3R通道的开放。IP3R通过以上几种正反调控机制使胞内钙的浓度处于动态平衡，维持细胞的正常生理状态。
本组实验研究通过免疫组化方法观察到自体移植皮片中IP3受体表达量明显增加，在前期研究中亦发现皮片中钙调蛋白的表达量明显增加，说明皮片中钙信号表达的增加与胞内IP3受体激活后刺激内质网钙库释放钙离子有关，推测存在某种因素抑制Ca2+与CaM对IP3受体的负反馈作用或者是IP3受体调控胞库内钙释放的阈值提高，使IP3受体表达增加，进而促进胞内钙离子的释放，导致钙信号转导增强，从而增加黑素细胞的黑色素合成与分泌，促进自体移植皮片的色素沉着。
自体移植皮片中黑素细胞合成、分泌黑色素的功能增强，有许多因素参与调控，过程较为复杂。本研究结果显示自体移植皮片黑素细胞中IP3受体激活后刺激内质网钙离子释放，钙信号发挥第二信使作用参与调控黑素细胞黑素合成、分泌过程，促进自体移植皮片色素沉着。有研究显示内皮素、血管紧张素Ⅱ、血管加压素和白三烯[14]等可刺激细胞内IP3水平增高促进细胞内Ca2+释放，但在自体移植皮片过度色素沉着过程中，是何原因引起细胞内IP3受体表达增高，导致细胞内钙信号转导增强，在此过程中是否还存在细胞外钙内流的增加目前都还不清楚，需进一步研究观察。
[参考文献]
[1]薛春雨,李蠡,邢新,等.黑皮素-1受体对皮肤色素的调控作用[J].中国美容医学,2003,12(5):542-544.
[2]薛春雨,邢新,李蠡等.自体移植皮片中α-黑素细胞刺激素的表达与黑色素含量的相关性[J] ......
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