富含血小板血浆双相接种法构建组织工程骨(2)
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参见附件(4703KB，6页)。
诱导7天后，用CAKP试剂盒(中国南京建成生物工程研究所)进行ALP染色。成骨细胞胞质中可见红或棕色ALP阳性颗粒。诱导14天后，用茜素红(中国阿拉丁试剂有限公司)进行钙结节染色。钙化结节呈现不同的红色。
1.4 PRP和PPP的制备：中国青山羊一只，5月，10kg。速眠新1.5ml肌肉注射麻醉。50ml注射器内含5mlACD(0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖溶于100ml双蒸水)，于颈静脉抽取全血40ml，离心1 000g，15min，取上层血浆二次离心，3 000g，20min。上层为清亮的PPP，移入另一5ml离心管中备用。中间层为白色的血小板团轻用吸管吸出移至另一离心管中。用少量PPP将血小板团重悬，人工血小板计数，调节成浓度为106/μl 的PRP备用[14-16]。PPP中血小板浓度104/μl。
1.5 PLGA支架预处理：PLGA支架由济南岱罡生物科技有限公司提供。PLA:PGA=75:25。孔径大小100～300μm，空隙率80%。将大块PLGA切成5mm×5mm×3mm小立方体，供体外研究使用。PLGA立方体浸泡于75%酒精中消毒24h，PBS漂洗3次，DMEM孵育30min，取出至于无菌纱布上，吸干大部分水分。
1.6 三种接种方法构建细胞/支架复合体：方法一，为传统静置接种法，即DMEM重悬细胞，调节细胞密度至5×106/ml。滴加80μl细胞悬液/支架，37℃，5% CO2，孵育2h，移入六孔板，每孔5ml诱导培养基。方法二，PPP重悬细胞，调节细胞密度至5×106/ml。滴加80μl细胞悬液/支架，随即滴加30μl凝血酶溶液(10 000IU凝血酶(Sigma，USA)加入10%CaCl2(Sigma，China)中)，加盖，37℃，5% CO2，孵育30min，移入六孔板，每孔5ml诱导培养基。方法三，PRP重悬细胞，其余同方法二。每3天换一次液。接种后24h 倒置显微镜下观察。
1.7 细胞/支架复合体电镜扫描：细胞/支架复合体培养3天、7天后，2.5%戊二醛固定，30%～100%的梯度乙醇脱水，真空干燥，表面喷金处理后在扫描电镜下观察照相。
1.8 细胞/支架复合体DNA定量分析：分别于1天、5天、9天、14天每组取4个细胞/支架复合体，PBS漂洗两次，放入7ml离心管中，剪成小块，加1ml骨细胞消化液[11,13]，37℃水浴2h。将消化混合液吸入另一个7ml离心管，超声细胞破碎机处理5次,6s/次,共30s，离心200g，5min，取上清液待用。
上清液40μl置于96孔黑色不透光酶标板内，每个样本两个副孔，每孔加160μl Hoechst 33258(Sigma，USA)测试液(1μg/ml)，放入荧光酶标仪样品槽，震荡混匀30s，选择激发波长360nm，发射波长460nm，测定样品的荧光强度。以小牛胸腺DNA(Sigma USA)做标准曲线。实验重复3次。
1.9 细胞/支架复合体ALP活性定量分析：取方法8中的上清液，用碱性磷酸酶试剂盒(中国南京建成生物工程研究所)测定ALP活性。50μl上清液加500μl缓冲液、500μl基质液，充分混合，37℃水浴3h。分光光度计520nm测定吸光度。吸光度的OD值代表复合体的ALP活性。实验重复3次。
1.10 细胞/支架复合体成骨基因相对定量分析：每个复合体置入2ml Eppendorf 管中，加入1mlTrizol(Invitrogen，USA),剪碎复合体, 4℃放置1h,待复合体完全溶解于Trizol，提取总RNA。根据反转录试剂盒(ABI,USA)提供的实验步骤，反转录合成cDNA。各引物均由北京基莱生物科技有限公司合成。实时定量PCR反应体系为25μl，ABI7900HT定量PCR仪(ABI,USA)的反应程序：50℃ 2min→95℃ 10min →(95℃ 15s → 60℃ 1min)×40个循环→95℃ 15s→ 60℃ 1min→95℃ 15s---20℃终止反应。管家基因GAPDH作为内对照，每个样本设置3个复孔。管家基因和目的基因的引物核苷酸序列，产物大小，退火温度总结于表1。 对于每一个样本CT 值是PCR产物达到可探测的荧光强度时复制循环次数。用2-△△CT方法计算每个目的基因每个时间点的现对表达水平。对于每一个目的基因，△△CT=(CT,目的基因-CT,管家基因)Time x-标准△CT，标准△CT为DMEM组(CT,目的基因t-CT,管家基因)Time 0[17]。
1.11 每个数值以平均值±标准差表示，组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey's test。设P<0.05具有统计学显著差异性。表1。
2结果
2.1 BMSCs成骨诱导培养：BMSCs诱导培养7天后，ALP染色为阳性，诱导14天后，茜素红染色为阳性。说明本实验条件下，自山羊骨髓中可分离培养出骨髓基质细胞，经诱导后，可向成骨细胞分化(图1)。
2.2 三种接种方法接种效率比较：细胞接种后24h，光学显微镜下观察，DMEM组的六孔板底以复合体为中心布满贴壁的BMSCs，PRP组六孔板底以复合体为中心布满血小板，PPP组六孔板底清洁，偶见单个细胞(图2)。
扫描电镜观察显示，DMEM组支架表面粘附的细胞明显较PPP和PRP组少，PPP和PRP组支架表面不仅粘附大量细胞还有胶原纤维附着。7天时，PPP和PRP组支架表面的细胞呈现伸展平铺状态(图3A、B)。
细胞接种后24h，细胞/支架复合体内DNA检测显示，DMEM组的DNA含量显著低于PPP和PRP组(P<0.05)，而PPP和PRP组的DNA含量无差别(图4)。
2.3 BMSCs/PLGA复合体内BMSCs增殖比较：复合体中DNA的含量代表BMSCs的数量，DNA的增加表示BMSCs的增殖，数据如图4所示。在DMEM组中，从接种后1～9天，BMSCs快速增殖(P<0.05)，但从9～14天，BMSCs增殖进入平台期(P>0.05)。PRP组中的BMSCs显示了同样的趋势。但PRP组中的BMSCs自接种后1～14天，一直显著增殖(P<0.05)。5天，9天，14天PRP组的BMSCs显著高于其他两组(P<0 ......
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