富含血小板血浆双相接种法构建组织工程骨(3)
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总的趋势是，PRP组的成骨性基因表达在培养早期明显低于其他两组，但随着培养时间延长，PRP组的基因表达逐渐上调，14天时都达到最高水平。
3讨论
骨组织工程研究中，三维多孔支架已经广泛用于构建组织工程骨[18-19]。但是，细胞与支架的复合效率却不令人满意[2,20-27]，而且有研究显示，体内的成骨只发生在支架的周边，在多孔支架的中心无骨组织形成[20,28-29]。这可能是由于在细胞接种时，细胞不能进入支架的内部[20]，而且随着细胞的粘附和扩增进一步阻碍了细胞向支架内部移动[26]。可见，细胞接种是构建细胞/支架复合体的关键，直接影响骨再生的质量。因此，很多学者研究了有利于细胞均匀分布于三维多孔支架内的接种方法，例如低压接种系统[20]，生物反应器灌注系统[2,21]，旋转烧瓶接种法[7]，离心接种法[25,27]，及表面声波技术[26]。这些接种技术均表现出良好效果，但是有些需要特殊设备不利于普及推广，有些步骤繁琐、耗时长增加了污染的机会。与这些技术相比，由纤维蛋白原和胶原介导的双相接种法简单、经济、方便、适用于各种细胞和支架。它也属于静置接种法，但是与传统静置接种法不同的是，通过纤维蛋白原和胶原的变相功能可以把细胞固定在支架中，而且有研究表明此方法可以使细胞均匀分布支架中[3,7-13]。
另一方面，随着三维支架孔径增大孔隙率提高，支架表面积与体积的比值必然下降，所以致使只有与孔壁接触的细胞能够粘附于孔壁表面，而那些悬在孔中的细胞则会被培养基冲洗掉或沉淀至支架底部[7]。纤维蛋白原和胶原作为细胞接种媒介可以通过凝成凝胶将悬在孔中的细胞包埋固定在支架内，从而提高细胞接种效率[3,7-10]。但是，其他接种方法没有这个功能，因此，我们认为由纤维蛋白原和胶原介导的双相接种法是值得推广和进一步研究的。
本研究用PRP代替纤维蛋白原和胶原作为双相接种媒介输送细胞至支架内,目的在于进一步改进双相接种法。
结果显示，PRP和PPP (自体纤维蛋白原) 都可以将BMSCs 全部复合在支架中，几乎没有细胞散落；扫描电镜也显示PRP和PPP组复合体表面粘附大量细胞；在细胞接种后24h，PPP和PRP组复合体的DNA量显著高于DMEM组。这些都说明PRP与PPP一样可以通过凝胶作用显著提高细胞接种效率。但是，随着培养时间延长，PRP组BMSCs 的增殖速率显著较PPP组快，这表明PRP较PPP更能促进BMSCs的增殖。在以往的研究中，只有高浓度的PRP(2.5×108血小板/细胞支架复合体)才能有效促进细胞增殖，低浓度的PRP(0.625×108 and 0.16×108血小板/细胞支架复合体)没有明显效应[30]。但是，我们的研究中，PRP的浓度是0.8×108血小板/细胞支架复合体，仍然显示明显的促BMSCs增殖作用。这可能是因为血小板和细胞一样充填并被固定在孔隙中，当血小板被凝血酶激活后，释放生长因子等大量活性蛋白，通过类似旁分泌的作用方式作用于周边的BMSCs，所以，尽管PRP的浓度不高，但作用很强。而以往的研究，只是将PRP凝集在细胞支架复合物的表面，血小板释放的活性蛋白不容易渗入支架内部发挥作用，所以只有通过提高PRP浓度才能表现出明显的生物学效应[30]。
有实验显示经高浓度PRP做用的BMSCs，其ALP活性下降，因此认为PRP抑制BMSCs的成骨分化[30-31]。本实验结果显示，在培养早期(5天内)，PRP组ALP活性与其他两组无明显差异，可这个时期PRP组的BMSCs数量却明显较其他两组多，这似乎表明BMSCs的成骨分化被抑制。但是随着培养时间延长，PRP组ALP活性迅速上升，到9天、14天已经显著高于其他两组。因此，我们认为并不是PRP抑制了BMSCs的成骨分化，而是由于PRP的促细胞增殖作用使PRP组中的BMSCs在培养早期大多数处于有丝分裂状态或刚刚完成分裂，也就是处于未分化状态，当BMSCs完成增殖，开始发育成熟转变为成骨细胞，ALP活性也随之增加。Arpornmaeklong等的研究也表明经高浓度的PRP作用的细胞支架复合体，细胞ALP活性在15天后开始增高[30]。
为了进一步明确PRP对BMSCs成骨分化的影响，我们对细胞支架复合体中成骨性基因ALP、 CollagenⅠ、Osteonectin的表达进行相对定量分析。结果显示，在细胞支架复合体培养早期，PRP组3个成骨基因的表达较其他两组低，但是随着培养时间延长，表达迅速上调， ALP在9天时达各组最高水平， CollagenⅠ和Osteonectin 14天时达到3各组最高水平。此结果与ALP活性分析结果相符，这说明PRP并不是抑制了BMSCs的成骨性分化，而是因为培养早期，BMSCs处于增殖状态，当其完成增殖时必然会向成骨方向分化，也就是说，PRP不是抑制了BMSCs的分化，而是由于促进细胞增殖的原因而使分化推迟了。
PRP已经被广泛应用于临床及实验研究，除了与BMSCs或自体松质骨颗粒混合可以促进骨组织再生外[14,32-34]，它还可以用于像面颈部除皱、乳房缩小或增大等美容整形手术，以减少术后血肿、血清肿、瘀斑、肿胀[36-37]。PRP还被用于置入牙种植体或人工骨移植物周围以提高和加速骨整合[16,38]。但据我们查阅的大量文献，至今没有研究将PRP用于细胞接种，我们首次提出PRP双相接种法，经实验检测，效果良好。
从本实验方法可以看出，PRP双相接种法是一个很实用的接种方法。PRP可以由自体全血经两步离心获得，无毒、无免疫源性，因此说此方法既安全又经济。如果与其他方法结合，如低压接种法、离心接种法，可能会更有效地输送细胞至三维多孔支架内。此方法也适用于其他细胞系的接种，用于其他组织的组织工程学研究，如脂肪、软骨。
4结论
本研究结果显示：以富含血小板血浆(PRP) 为媒介的双相接种法，不仅可以大大提高BMSCs接种于三维多孔PLGA支架的效率，还可以促进BMSCs在支架中的增殖 ......
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