凝血酶对人皮肤成纤维细胞增殖作用的研究(2)
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1材料和方法
1.1 材料
1.1.1实验标本：标本取自整形外科患者手术中修剪掉的正常皮肤。
1.1.2 主要实验试剂：胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，杭州四季青)，DMEM(H)培养液(Hyclone)，0.25%胰蛋白酶(Gibco BRL)，青霉素-链霉素溶液(Hyclone)，PBS缓冲液(Hyclone)，羟脯氨酸(瑞士Fluka公司)，氯胺T(上海化学试剂公司)，二甲氨基苯甲醛(天津化学试剂研究所)，高氯酸(天津市东方化工厂)，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 (北京天来生物医学科技有限公司)，波形蛋白单克隆抗体(上海肯强仪器有限公司)，SP法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)，α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(武汉博士德生物公司)，凝血酶(Sigma公司)，阿加曲班(日本三菱制药株式会社)。
1.1.3主要实验设备：超净工作台(北京碧都空气净化设备公司)，22560酶标仪(Biotrak，Austria)，Soruau T21 高速冷冻离心机(Kendro，USA)，3111细胞培养箱(Thermo Forma，USA)，OLYMPUS TH4-200 倒置显微镜(OLYMPUS，Japan)，Ultrospec 3300pro分光光度计(Biochrom，England)。
1.2 试验方法
1.2.1人皮肤成纤维细胞的分离、培养
1.2.1.1人皮肤的取材：在无菌条件下将所取的正常人皮肤立即置入无血清的DMEM培养液中。
1.2.1.2人皮肤成纤维细胞的培养：在超净工作台内将皮肤置于培养皿中，常规处理后，放在 37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱，4h后将培养瓶缓慢放平，静止培养。7天后在倒置相差显微镜下观察，有成纤维细胞游离出，并进行传代培养。
1.2.2 成纤维细胞的鉴定
1.2.2.1 形态学：用Olympus倒置显微镜观察成纤维细胞的形态。
1.2.2.2 波形蛋白免疫组化：①细胞固定：取第二代生长状态良好的成纤维细胞，用0.25%胰酶消化后接种于置有盖玻片的6孔板中，待细胞爬满后取出玻片，0.01M PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，0.01M PBS清洗5min×4次；②染色方法：按照北京中杉金桥生物技术有限公司产品SP-9000试剂盒提供的方法进行操作。鼠抗人波形蛋白单克隆抗体的工作液浓度为1:50。
1.2.3 MTT法检测成纤维细胞活性：取对数生长期的成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，调整浓度为3×104/ml，接种于96孔板内，0.1ml/孔。置培养箱内孵育24h，待细胞完全贴壁后更换为含凝血酶(凝血酶粉剂溶解于生理盐水中，-20℃贮存，浓度为1 000U/ml)和阿加曲班(1mg/ml)的培养液。共设9个组，分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I组，每组设10个复孔：A组加入单纯培养液，不加入凝血酶和阿加曲班；B、C、D、E组加入培养液的凝血酶终浓度分别为0.5U/ml、1U/ml、5U/ml、10U/ml；F组加入的培养液含阿加曲班10μg/ml；G、H、I组加入的培养液中，凝血酶终浓度分别为1U/ml、5U/ml、10U/ml，阿加曲班终浓度分别为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。置培养箱中孵育72h后，每孔加入10μl MTT(5mg/ml)继续孵育4h，细胞内会产生深紫色的结晶，之后每孔加入100μl溶解液，孵育3～4h，直至镜下观察见深紫色结晶完全溶解。用酶标仪检测570nm吸光度，吸光度值的大小反映成纤维细胞成活数量及活性。
1.2.4氯胺T法测上清中羟脯氨酸的含量[6]：取对数生长期的成纤维细胞，以0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液调整细胞浓度为3×104个/ml，按5ml/瓶接种于25cm2培养瓶内，24h后待细胞贴壁后，换成含有凝血酶和阿加曲班的培养液。共设9个组，分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I组：A组加入单纯培养液，不加入凝血酶和阿加曲班；B、C、D、E组加入培养液的凝血酶终浓度分别为0.5U/ml、1U/ml、5U/ml、10U/ml；F组加入的培养液含阿加曲班10μg/ml；G、H、I组加入的培养液中，凝血酶终浓度分别为1U/ml、5U/ml、10U/ml，阿加曲班终浓度分别为1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。继续培养72h。以0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液调整各组细胞浓度为1×104个/ml，按1ml/孔接种于24孔板，每组设8个复孔，8h后待细胞贴壁后换液，继续培养72h。取上清液进行检测。
取无细胞培养液作为空白组，排除外源性羟脯氨酸影响。检测时将上清1ml加入有盖试管中，加浓盐酸1.2ml，110℃烘箱中水解2h，加40%氢氧化钠1.2ml，加水稀释至10ml，以1N盐酸及1N氢氧化钠调pH值至6.0，3 000 r/min离心10min，取上清液1ml，加水1ml、0.05mol/L氯胺T 1ml混匀。25℃水浴，充分振荡2次，加1ml过氯酸，混匀，置5min，加10%二甲氨基苯甲醛1ml，混匀，100℃水浴2 min，冰水冷却。用PU8800型分光光度计，在560 nm处比色，读D值。以羟脯氨酸(HPr)标准液作标准曲线，得出样品中羟脯氨酸的含量。
1.2.5 α-SMA抗体免疫组化染色：取对数生长期的成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，调整浓度为3×104/ml，接种于25cm2培养瓶中，每瓶5ml。置培养箱内孵育24h，待细胞完全贴壁后更换培养液，分为4组：A组培养液中不加凝血酶，孵育72h；B组培养液中凝血酶浓度1U/ml，孵育24h；C组培养液中凝血酶浓度1U/ml，孵育72h；D组培养液中凝血酶浓度1U/ml，阿加曲班浓度为1μg/ml，孵育72h。
1.2.6 细胞固定：成纤维细胞用0.25%胰酶消化后接种于置有盖玻片的6孔板中，待细胞爬满后取出玻片，0.01M PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，0.01M PBS清洗5min×4次。免疫组化染色方法同上 ......
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