凝血酶对人皮肤成纤维细胞增殖作用的研究(3)
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2.4 α-SMA抗体免疫组化染色结果：(见图2)。
3讨论
3.1 关于凝血酶的作用：凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，除了在血液凝固过程中起关键作用外，在组织修复和伤口愈合过程中也有很重要的作用。凝血酶是成纤维细胞的促有丝分裂剂和化学引诱物[3-5]。有学者证明浓度为1nM以上的凝血酶能刺激人胎儿肺成纤维细胞的前胶原生成增加，浓度为10nM的凝血酶能使前胶原生成增加60%～117%，并证明凝血酶的这种作用是通过PAR-1的蛋白水解激活而实现的[7]。Hewitso等用凝血酶刺激大鼠的肾间质成纤维细胞发现，0.1U/ml和0.5U/ml的凝血酶分别使培养的细胞数较对照组增多66%±41%和47%±41%，0.5U/ml的凝血酶使细胞的I型前胶原增多2.4倍[8]。
3.2 关于MTT和羟脯氨酸含量的检测
3.2.1 本实验用不同浓度的凝血酶刺激人皮肤成纤维细胞，观察成纤维细胞活力、数量和胶原分泌能力的变化，并应用一种高活性的凝血酶抑制剂-阿加曲班，对凝血酶的作用进行干预，观察阿加曲班抑制凝血酶的效果，并观察阿加曲班对成纤维细胞的作用。
3.2.2 关于凝血酶在体外细胞培养实验的用量问题，国内外文献报道了0.1～40U/ml不等的用量。我们在实验中选用浓度为0.5U/ml、1U/ml、5U/ml、10U/ml的凝血酶。阿加曲班是一种直接型凝血酶抑制剂，能快速、选择性、可逆性的阻断凝血酶的催化位点及非极性区，从而抑制凝血酶的作用。阿加曲班对凝血酶具有高度亲和性，有研究表明[9]，阿加曲班阻断50%游离凝血酶的浓度为1.1μmo1/L。根据这种换算方式，1ml液体中加入0.57μg的阿加曲班即可达到1.1μmo1/L的浓度，为了达到完全抑制凝血酶的效果，我们应用1μg/ml的阿加曲班来抑制1U/ml的凝血酶。
3.2.3 本实验采用MTT法检测细胞的数量和活力。实验结果表明，加入不同浓度凝血酶的各组(B、C、D、E组)吸光值均高于不加凝血酶组(A组)，其中凝血酶浓度为1U/ml(C组)的吸光值最高，与其他组相比有显著差异。这说明凝血酶具有刺激成纤维细胞增殖的能力，当浓度为1U/ml时凝血酶的这种能力最强。加入不同浓度的凝血酶和阿加曲班的各组(G、H、I组)吸光值组间无差异，与A组相比无统计学差异。这一结果表明培养液中加入凝血酶抑制剂阿加曲班后，凝血酶的作用被抑制，失去了刺激细胞增殖的功能。单纯加入阿加曲班10μg/ml(F组)的吸光值与A组相比无统计学差异，表明阿加曲班对人皮肤成纤维细胞既无刺激增殖的作用，也没有抑制作用。
3.2.4 羟脯氨酸是合成胶原的特有材料，在胶原中的含量较为稳定，因此在临床和实验中，胶原总量的测定常采用羟脯氨酸法，间接反映总胶原蛋白含量[10]。我们应用氯胺T法检测培养液上清中羟脯氨酸含量，以检测成纤维细胞分泌胶原蛋白的能力。本实验的设计是先以不同浓度的凝血酶刺激细胞，然后再取数量相等的细胞在不含凝血酶的培养液中培养72h后，检测上清中的羟脯氨酸含量，这样可以排除凝血酶刺激细胞增殖的影响，检测受到不同浓度凝血酶刺激后的数量相同的细胞胶原蛋白分泌量。实验结果表明使用不同浓度凝血酶的各组(B、C、D、E组)上清中羟脯氨酸含量均高于不加凝血酶组(A组)，其中凝血酶浓度为1U/ml和5U/ml(C组和D组)的羟脯氨酸含量最高，与其他组相比有显著差异。这一结果表明凝血酶刺激后的成纤维细胞，在没有凝血酶的环境中仍有较高的胶原分泌量。含有不同浓度凝血酶和阿加曲班的各组(G、H、I组)羟脯氨酸含量与A组相比无统计学差异。这说明阿加曲班抑制了凝血酶的作用，使凝血酶失去了刺激细胞增加胶原分泌的能力。含有阿加曲班10μg/ml的F组羟脯氨酸含量与A组相比无统计学差异，这显示阿加曲班对成纤维细胞的胶原分泌无明显作用。
3.3 关于凝血酶刺激α-SMA的表达：在很多关于纤维变性病变的文献中，把表达α-SMA的成纤维细胞称为肌成纤维细胞(myofibroblast, MF)[11-13]。MF胞胞浆内含有大量的微丝，具有平滑肌细胞的收缩能力，是创面收缩的动力细胞[14]。扩张器周围的纤维囊壁中含有大量的MF，MF的收缩活性不仅会使组织扩张的进程减慢，而且还会使扩张后的组织回缩率增高，影响实际的扩张面积和手术应达到的预期效果。体外培养也证实[15]，成纤维细胞可以受刺激分化，获得表达α- SMA的能力而成为MF。关于凝血酶是否能刺激成纤维细胞使其表达α-SMA，尚存在争议。Galina S Bogatkevich等[16]的研究表明凝血酶刺激正常肺成纤维细胞表达α-SMA，变为肌成纤维细胞表型，并证明凝血酶的这种作用是通过蛋白激酶C信号转导途径实现的。而Hewitso用凝血酶刺激大鼠的肾间质成纤维细胞没有发现细胞中α-SMA表达的变化[8]。本研究用1U/ml的凝血酶刺激成纤维细胞，应用免疫组化的方法证明受到凝血酶刺激的细胞胞浆内有α-SMA的表达，而且这种表达是随刺激时间延长而增强的。加入阿加曲班的D组细胞内只有极弱的α-SMA表达，这说明阿加曲班抑制了凝血酶的作用，抑制了α-SMA的表达。
本实验证实了体外培养的人皮肤成纤维细胞受到一定浓度凝血酶刺激后，胶原分泌量增加，细胞浆内有平滑肌肌动蛋白表达。在体内，血肿形成后会产生大量凝血酶，血液凝固时产生的一些与纤维蛋白结合的凝血酶可持续存在于血肿内，并可缓慢释放到周围的组织中[17]。依据本实验结果，我们可以推论这些血肿形成后被释放出的凝血酶会持续刺激血肿周围组织的成纤维细胞增殖，产生大量胶原蛋白，并使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。本实验的结果可作为进一步研究血肿对皮瓣毒性作用的基础。
[参考文献]
[1]鲁开化,艾玉峰,郭树忠. 新编皮肤软组织扩张术[M]. 上海:第二军医大学出版社,2007:57-58.
[2]Worseg A,Kuzbari R,Tairych G,et al ......
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