骨髓间充质干细胞对自然衰老小鼠T细胞的调节作用研究(2)
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目前人们对骨髓间充质干细胞的生物学特性和作用的研究逐步深入。它不仅具有强大的自我更新能力，同时它还具有成骨、成软骨、成脂肪[7-8]、成肌[9]等向中胚层组织细胞分化的潜能，甚至具有向神经样细胞[10-11]等跨胚层分化能力。本实验拟在研究小鼠骨髓间充质干细胞对正常衰老小鼠的T细胞的调节作用，为下一步深入探讨骨髓间充质干细胞对衰老的调节作用奠定基础。
1材料和方法
1.1实验动物：C57BL/6N小鼠12月龄15只，雌性，体重约30g。C57BL/6N小鼠6～8周龄5只，雌性，体重约20g。以上动物均为SPF级动物。
1.2仪器、试剂：CO2细胞培养孵箱(日本Hirasawa Works 公司)、Biofuge离心机(德国Heraeus公司)、Transwell培养皿(美国corning公司)、FACS Aria流式细胞仪(美国BD公司)、RPMI1640培养基(美国Hyclone公司)、DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)、特级胎牛血清(美国Gibco公司)、PE-anti-mouse CD8(美国biolegend公司)、FITC-anti-mouse CD28(美国biolegend公司)、小鼠淋巴分离液(中国医学科学院生物工程研究所)、200目细胞筛、10ml玻璃注射器。
1.3方法
1.3.1BM-MSCs细胞培养和传代：BM-MSCs购自于广州Cyagen公司，取自6～8周C57BL/6N雌性小鼠第六代细胞，先将BM-MSCs复苏，移入10cm培养皿中，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基10ml，细胞融合70%～80%后传代，取出第九代细胞计数后，分成每106一份，10份备用。
1.3.2小鼠淋巴细胞悬浮液制备：麻醉小鼠，用碘汀消毒酒精脱碘后，断颈处死小鼠左下腹部剪开皮肤进入腹腔，分离出脾脏，PBS冲洗两遍，放到200目细胞筛上用10ml玻璃注射器内芯进行研磨，研磨后用RPMI1640培养基冲洗两边，放入5ml小鼠淋巴细胞分离液中，2 500rpm、20min慢加速慢减速离心，吸取第二层白色浑浊层，加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基10ml，1 500rpm、10min离心，移去上清，用15%胎牛血清的RPMI1640培养基10ml重新悬置，细胞计数后备用。
1.3.3分组和处理
1.3.3.1 实验一：①衰老组：五只12月龄的不同小鼠的106淋巴细胞放入培养皿加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基培养；②年轻组：五只6～8周龄的不同小鼠的106淋巴细胞放入培养皿加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。
1.3.3.2 实验二：①隔离共培养组：BM-MSCs与淋巴细胞以1:1比例放入Transwell系统，淋巴细胞取自不同的五只小鼠，加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基共培养；②混合共培养组：BM-MSCs与淋巴细胞以1:1比例放入六孔板中，淋巴细胞取自不同的五只小鼠，加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基共培养；③对照组：五只不同小鼠的106淋巴细胞放入培养皿加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。
1.3.4检测：以上实验组和对照组在37℃、5% CO2细胞培养孵箱里培养48h后，吸出淋巴细胞，离心后加入100μl细胞染色缓冲液，隔离共培养组、混合共培养和对照组加入PE-anti-mouse CD8、FITC-anti-mouse CD28。4℃孵育40min，细胞染色缓冲液冲洗两遍，用流式细胞仪检测。
1.3.5 统计学方法：采用SPSS 13.0统计软件，所有数据用(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验。P<0.05有统计学意义。
2结果
2.1 培养48h后衰老小鼠CD8+ CD28+ T细胞比例为(4.08±0.3493)%，低于年轻小鼠CD8+ CD28+ T细胞比例为(5.04±0.5741)% ，两者相比P<0.05，有统计学差异( 图1)。
2.2隔离共培养组的CD8+ CD28+ T细胞比例为(10.26±1.0784)%，与对照组(4.08±0.3493)% 相比有显著提高，P<0.001；混合共培养组的CD8+ CD28+T细胞比例为(6.42±1.5680)%与对照组相比升高，P<0.05，但却显著低于隔离共培养组，P<0.01(图2)。
3讨论
3.1 骨髓间充质干细胞具有的免疫调节的作用目前备受关注。通过在体外的共培养，现在已经发现骨髓间充质干细胞可以将DC细胞转化成一种全新的DC细胞[12]，还有学者发现BM-MSCs对巨噬细胞也有强大的调理作用[13]，甚至还有学者将骨髓间充质干细胞与各种免疫细胞共培养，骨髓间充质干细胞都可以发挥其自身的免疫调节作用[14]。
3.2 对于本实验我们首先要说明的是：①12月龄的小鼠相当于人年龄的40～50岁，6～8周龄相当于人15～20岁；②实验所用的脾细胞为混合的淋巴细胞，脾细胞主要由B细胞和T细胞组成，其中T细胞大概有40%，CD8和CD28仅在T细胞上共表达，我们并没有将T细胞从这种混合淋巴细胞中独立分离研究主要是因为在体内T、B细胞是混合在一起的，虽然我们是在体外研究BM-MSCs对衰老的影响，但是我们还是想尽量模仿体内的环境状态，了解在其他细胞的参与下BM-MSCs是否可以发挥对衰老T细胞的影响作用；③整个实验并没有加入有利于促进T细胞生长增殖的IL-2、anti-CD3、anti-CD28，因为这些因素可能会引起实验误差；④ T细胞的活化必须由两个信号的传入完成，第一个是T细胞表面的CD3-TCR与抗原递呈细胞的MHC分子结合，此为第一信号；第二个是T细胞表面的CD28与抗原递呈细胞表面的B7分子结合，此为第二信号，这两个信号缺一不可，来自CD28第二信号的缺乏将导致免疫无能[15]；⑤实验一仅仅是为实验二提供可靠的实验依据，经过研究发现培养48h后衰老小鼠的CD8+CD28+共表达率低于年轻小鼠，这表明CD8+CD28+的共表达是可以作为小鼠衰老的指标的，这也和其他学者的研究基本相符。在此仍需说明的是衰老小鼠和年轻小鼠的这种差异并没有直接检测而是在48h后进行检测的，这是因为没有IL-2、anti-CD3、anti-CD28 T细胞在培养中必然会发生凋亡，为了实验的准确性，我们选择和实验二同样条件下对这些指标进行检测。实验二的目的就是想通过研究骨髓间充质干细胞对衰老T细胞表面标记CD8+CD28+共表达的影响作用，为下一步对免疫老化的研究打下基础。结果表明，BM-MSCs可以有效的提高衰老T细胞表面的CD8+CD28+的共表达率。换句话说，骨髓间充质干细胞让衰老的T细胞变“年轻”了 ......
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