TBX22基因多态性与非综合征性唇腭裂相关关系的研究
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1.2 试剂及仪器：Puregene DNA纯化试剂盒(美国GENTRA公司)；高保真PfuPCR试剂盒(南京天为有限公司)；扩增引物由上海英骏生物公司合成；MG5331 PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)。
1.3 DNA提取：样品采集：抽取患儿及父母、对照儿童外周静脉血4ml，EDTA抗凝。按PUREGENE DNA纯化试剂盒的说明书抽提外周血白细胞基因组DNA。
1.4 PCR扩增：扩增引物：上游引物为：5'-TGTGTGCACA TGGTGGAGGT-3'；下游引物为5'-AGTGAGACTCCATCTCAGGA-3'。反应体系：总反应体系25μl，其中上下游引物各1μl(10pmol/μl)，模板DNA 0.5μl(100ng/μl)，2×Pfu PCR Master Mix 12.5μl，ddH2O 10μl。PCR反应条件：94℃变性3min，PCR循环条件为94℃30s，58℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸4min。1.6%琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测PCR扩增结果。
1.5 纯化测序：纯化测序由华大基因科技有限公司完成。对发现阳性结果的核心家庭进行重复测序，以检测测序结果的可靠性，若两次结果不一致，再进行双向测序，保证测序结果的可信度。测序引物由测序公司设计合成。
1.6 测序结果判读：用Chromas 2.0软件对测序峰图进行分析，判断杂合子和纯合子，从而得到核心家庭的基因序列，用Dnastar软件对核心家庭的基因序列与Pubmed提供的正常序列进行对比，发现突变位点。
1.7 统计学处理：统计由SPSS14.0软件完成，进行如下统计：①患儿组与父母组基因型分别做Hardy-Weinberg平衡检验；②比较实验组患儿与对照组儿童的基因型构成及等位基因频数做卡方检验；③对核心家庭的父母及患儿各位点基因型及等位基因频数进行比较和单体型相对风险分析(Haplotype relative risk, HRR)；④选取亲代至少有1位是杂合子的核心家庭作传递不平衡检验(transmission disequilibrium test, TDT)。
2结果
2.1 PCR产物结果：TBX22基因exon3扩增的片段长度为251bp，PCR产物凝胶电泳图如图1。
2.2 测序结果：TBX22基因exon3扩增片段包含G359A、A361G突变位点。本研究测序结果与NCBI GeneBank数据库公布的TBX22序列比对后，发现G359A位存在多态性：图2对应63位碱基为G，图3对应65位碱基为A(这些位点均对应TBX22基因G359A位点)。A361G位点如图2所示对应65号位点为A，其余测序结果均未发现突变。
2.3 TBX22基因G359A多态性的统计学分析
2.3.1 患儿及其父母和对照儿童各位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验(P>0.05),见表1。
2.3.2 患儿与对照儿童基因型及等位基因频数比较，80例患儿中，GG基因71例，GA基因8例，AA基因1例；对照组80例中，GG基因79例，仅发现1例GA基因。组间进行卡方见，P<0.05，发现差异有显著性，见表2。
2.3.3 对80例核心家庭进行单体型相对风险分析(HRR)，发现G359A位点两等位基因在传递与未传递例数比较中差异无统计学意义，P>0.05，见表3。
2.3.4 传递不平衡检验计算中发现有11个核心家庭至少父母一方为杂合子，以患儿等位基因为病例，以父母未传递给患儿的一对等位基因为对照进行1:1配对的病例对照研究。结果TDT(χ2)=0.529，P>0.05，无统计学意义，见表4。
3讨论
3.1 唇腭裂是人类比较常见的出生缺陷之一，这种先天性畸形的发病率因国家、地区、种族不同而有所差异，平均约为1/700，其中亚洲发病率较高约1/500，欧洲居中约1/1000，非洲最低约1/2500[6]。唇腭裂的病人常常因为喂养困难、咬合、构音功能异常及外貌导致的心理问题等需要外科手术和后续的序列治疗，给家庭和社会带来沉重的负担[7]。根据是否存在其他先天畸形，可分为综合征型和非综合征型唇腭裂。以非综合征型唇腭裂为常见，它又可分为唇裂伴或不伴腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)以及单纯性腭裂(cleft palate only, CPO)。研究认为，70%的CL/P和50%的CPO是非综合征型的。
3.2 非综合征型唇腭裂的病因则涉及到多种因素，其中遗传和环境因素都起到了重要作用。对于遗传因素的研究，国内外学者采取全基因组扫描(Genome Scanning)的方法用于唇腭裂的基因定位，从中选择可能的候选基因进行基因变异检测。但这种方法工程浩大，耗时耗力，需要投入大量的时间和资金，且效果甚微。随后一些学者应用综合征型唇腭裂的易感基因作为候选基因来推断NSCL/P的基因[8]。首先综合征性唇腭裂大多为单基因疾病，符合孟德尔遗传定律，研究较方便，干扰因素少，且其综合征性唇腭裂部分表型同NSCL/P一致。目前发现的相关易感基因包括：IRF6(Van der Woude综合征,VWS), PVRL1(外胚层发育不良综合征,CLPED1)，P63(先天性缺指/趾畸形-外胚层发育不良-唇腭裂综合征,EEC)，FGFR1(Kallmann综合征)，MSX1(牙缺失合并唇腭裂，cleft lip and/or palate with hypodontia)等。近来关于综合征型唇腭裂的基因研究取得了很大进展，部分易感基因已在NSCL/P研究中明确作用，如：IRF6、PVRL1、MSX1。
3.3 Forbes对一个冰岛家庭和一个英国哥伦比亚家庭的研究后, 将引起X 连锁腭裂(X- linked cleft palate, CPX)的基因定位于Xq21.3[9]。Braybrook通过对冰岛CPX 大家系进行候选基因分析后发现TBX22 有突变[10]。CPX患者临床表现各异，除了有腭裂以外，还可能表现为悬雍垂裂或缺失、舌系带过短等。至今已发现CPX患病人群有十个突变位点，其中包括剪接位点突变，错义突变，无义突变,编码框移位 ......
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