放射治疗兔耳增生性瘢痕的实验研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
Key words:hypertrophic scar;radiotherapy;collagen fibers; electron linear accelerator
增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HS)，也称之为肥厚性瘢痕，是临床上常见的一种病理性瘢痕，其形成是由于创伤愈合过程中成纤维细胞合成与分解代谢紊乱，导致细胞外基质合成增多和过度沉积[1]。增生性瘢痕常发生在外科手术、外伤和烧伤后，不仅影响了美观，而且会出现瘙痒、疼痛等症状，甚至能引起严重的功能障碍[2]。因此，对增生性瘢痕的治疗成为了美容领域研究的重点和难点。虽然治疗增生性瘢痕的方法有很多种，但是都达不到完全治愈的效果。增生性瘢痕的放射治疗始于 1906 年，已有上百年的历史。既可作为增生性瘢痕的首选治疗模式，也可以作为外科手术的辅助治疗方法。因为单纯手术切除复发率高，据国外报道烧伤后增生性瘢痕的发病率达91%,手术后为40%～94%,与我国临床报道相似[3]。而单独二氧化碳激光治疗后复发率也超过50%[4]。但由于相关的基础研究较少，利用放射的方法治疗瘢痕尚未达成统一的规范和标准，即影响了放射治疗的效果，也增加了并发症。而对于放射治疗的最佳时间和合理剂量的确定，已成为研究的热点之一。本研究拟采用医用直线加速器产生的6Mev高能电子线，在总照射剂量相近的情况下，对兔耳增生性瘢痕模型，进行单次不同剂量和不同次数照射，寻求最佳单次照射剂量和照射次数，为临床治疗增生性瘢痕提供理论依据。
1 实验材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要实验试剂 、仪器及来源见表1。
1.1.2 实验材料：健康清洁级三四月龄日本大耳白兔18只，雌雄不限，体重范围1.5～2.0kg，由辽宁医学院实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 模型制作：选用18只日本大耳白兔的36个耳朵，耳缘静脉3%戊巴比妥钠(1.5mg/Kg)注射麻醉，麻醉生效后，剃去耳腹侧兔毛，常规消毒铺巾，在无菌条件下每只兔耳腹侧面用自制打孔器制作直径为6mm的圆形全层皮肤(深达软骨膜)缺损创面10个，创面间隔1.5cm。各组实验动物在喂养期间活动及进食水情况良好，均存活。共计360个缺损创面模型。每三只兔子为一组，随机分为6组。其中1组作为对照组(60个创面)，其余5组作为照射组，将照射组随机编号分成200cGy组(A组)、400cGy组(B组)、600cGy组(C组)、800cGy组(D组)、1000cGy组(E组)，每组60个创面。照射组术后立即采用医用直线加速器产生的6Mev高能电子线照射兔耳腹侧面创面。照射方案为：A组(2000cGy连续照射10天，每日一次，单次照射剂量200cGy)、B组(2000cGy连续照射5天，隔日一次，单次照射剂量400cGy)、C组(1800cGy连续照射3天，隔3日一次，单次照射剂量600cGy)、D组(1600c连续照射2天，隔5日一次，单次照射剂量800cGy)、E组(2000cGy连续照射2天，隔5日一次，单次剂量1000cGy)。创面采用暴露法，被照射创口周围用铅板防护。实验动物模型制作一个月后，对照组和照射组均切取瘢痕组织，进行光镜、电镜及组织学观察分析。
1.2.2 标本的处理：照射组取材范围包括创口周围部分皮肤及创面下部薄层肌肉组织。将标本组织置于4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，常规切片后行HE染色。电镜标本按照实验试剂盒所指示步骤制作后，行免疫组织化学染色。
1.2.3 免疫组织化学染色：常规石蜡切片脱腊和水化后，PBS(0.01M，pH7.4)漂洗3次，每次5min；3%H2O2去离子水孵育10min，枸掾酸盐抗原修复液高温高压修复2min,自然冷却至室温后PBS漂洗3次，每次5min，去除剩余PBS液；滴加稀释的一抗后,37℃孵育90min，PBS冲洗3 次，每次2min；去除剩余 PBS,滴加PV - 9000 试剂1(聚合物辅助剂)50μl,37℃孵育20min，PBS冲洗3次，每次2min；去除剩余 PBS,滴加PV - 9000 试剂2(辣根酶标记羊抗兔/鼠Ig G多聚体)50μl,37℃孵育30min，PBS 冲洗3 次，每次2min；每张切片滴加100μl新鲜配制的DAB溶液,显微镜下控制染色10min；蒸馏水冲洗，苏木精复染1min，PBS冲洗返蓝,梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察,拍照。
1.2.4 统计分析：采用SPSS14.0统计学软件，用χ2检验进行组间比较统计分析。P<0.05有显著性差异。
2 结果
2.1 大体观察情况：对照组的60个创面模型中，从第4天血痂形成，触之易脱落、出血，未发现瘢痕形成；第8天时，血痂形成比较牢固，未发现瘢痕形成；第11～13天时，创面开始愈合，血痂自动脱落，显露粉红色瘢痕组织；术后第12天开始，瘢痕组织逐渐高出皮肤，呈现淡红色，厚度约为兔耳厚度的1.5～2倍；术后30天时，60个创面，共形成增生性瘢痕48个，占80.0%，未形成增生性瘢痕12个，占20.0%。
2.2 不同照射方案对兔耳增生性瘢痕形成的影响：高能电子线照射组观察增生性瘢痕变化的过程与对照组相同。创伤7天后，A组、B组实验模型创面均无明显感染迹象，创面收缩变小明显；C组个别实验模型创面出现感染，经过创口抗感染处理后，情况好转；A、B、C3组实验模型创面，平均14天后，创口开始愈合；D组与E组，实验模型创面多处出现感染现象，伤口红肿、化脓、腐烂，创口经过抗感染处理后，仍未见明显好转。D组与E组，照射剂量对创口愈合的副作用较大，所以该两组的实验模型未纳入实验研究。
照射组A组,术后30天时，共形成增生性瘢痕28个，占46.7%，未形成增生性瘢痕32个，占53.3%；B组术后30天时，共形成增生性瘢痕23个，占38.3%，未形成增生性瘢痕37个，占61.7%；C组术后30天时，共形成增生性瘢痕36个，占60.0%，未形成增生性瘢痕24个，占40.0%；将照射后各组形成增生性瘢痕的结果进行比较发现，不同单次照射剂量，形成增生性瘢痕的数量不同。各剂量之间比较见表2。
2.3 HE染色：光学显微镜观察对照组1个月时瘢痕模型发现，表皮细胞层数较少，排列紧凑，上皮乳头消失，真皮层明显增厚，主要有大量的成纤维细胞增殖，成纤维细胞呈环形或旋涡状分布。其间见有大量的胶原纤维，排列致密且紊乱。见图1。
观察6Mev高能电子线照射组1个月时瘢痕模型发现，胶原纤维排列较整齐，成纤维细胞数量及血管数量少于对照组，随着照射量的增加，成纤维细胞的数量越少，胶原纤维也变的稀疏。见图2～4。
2.4 不同照射方案对VEGF、ACTIN表达的影响：各组增生性瘢痕组织中VEGF及ACTIN的表达情况见表3、3。免疫组化发现对照组VEGF、ACTIN的表达水平显著增高 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2931kb)。