男性雄激素源性脱发患者毛囊干细胞增殖和凋亡的初步研究(2)
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参见附件(2345KB，3页)。
1.1.5 实验分组 分正常对照组、AGA枕部非脱发区组、AGA脱发过渡区组及AGA脱发区组。
1.2 实验方法
1.2.1主要试剂和仪器：CK15单克隆抗体(小鼠抗人，Santa Cruz，USA)，PCNA多克隆抗体(兔抗人，Santa Cruz,USA)，Texas Red荧光二抗 (山羊抗小鼠，Proteintech ,USA)，FITC荧光二抗(山羊抗兔， Proteintech ,USA)，TUNEL试剂盒(Sigma，USA)；荧光显微镜(Olympus 81i，Japan)。
1.2.2 毛囊干细胞增殖活性和凋亡观察
1.2.2.1 毛囊干细胞的鉴定[10]：毛囊干细胞位于毛囊隆突部。本研究采用K15作为毛囊干细胞鉴定的标记物，如细胞浆染成红色即为毛囊干细胞。
1.2.2.2 毛囊干细胞增值活性观察：对预先处理的毛囊组织进行3μm连续切片，切片时以毛囊纵轴为方向。按照试剂盒操作说明对切片进行双重免疫荧光染色，对各组毛囊的CK15染色阳性的细胞中PCNA阳性细胞进行观察记数。
1.2.2.3 毛囊干细胞凋亡观察：操作方法同前。对对各组毛囊的CK15染色阳性的细胞中TUNEL阳性细胞进行观察记数。
1.2.4免疫荧光结果判定和记录：CK15免疫荧光阳性结果判定：细胞胞浆出现红色荧光。PCNA免疫荧光阳性结果判定：细胞胞核出现绿色荧光。TUNEL阳性结果判定：细胞胞核出现绿色荧光。每张切片用Olympus显微镜在图像分析系统下照相和计数，分别计算毛囊隆突部位CK15阳性细胞中PCNA阳性细胞的百分比和TUNEL阳性细胞数及总的阳性率。正常对照组和患者不同区域各观察5个毛囊，每组毛囊结果以均数±标准差(x±s)表示。
1.3 统计学分析：数据分析与统计学处理采用SPSS16.0完成。选单因素方差分析，结果有统计学意义，再进行两两比较，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 毛囊干细胞的增殖情况：各组毛囊隆突部位CK15阳性细胞中均有不等量的PCNA阳性细胞(图1a～d)，PCNA阳性细胞/CK15阳性细胞百分比见表1和图2。
从表1可以看出，CK15阳性细胞中PCNA阳性细胞率由高到低依次为：正常对照组、患者枕部非脱发区组、脱发过渡区组、脱发区组，四个组间比较有显著性的差异(F=12.046，P<0.001)；两两比较，除脱发过渡区组与脱发区组间比较无显著性差异(P>0.05)外，其它各组间比较，均有显著性差异(P<0.05)。
2.2 毛囊干细胞的凋亡情况：在各组毛囊中，CK15阳性细胞中均未见到有TUNEL阳性的细胞，但在隆突部可见TUNEL阳性细胞。各组毛囊隆突部位TUNEL阳性细胞率见表2和图3，四组间比较均无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
3.1 毛囊终生经历着生长期、退行期、静止期然后再进入下一个生长期的周期性生长过程。毛囊这种周期性的变化与毛囊干细胞周期性的分裂、增殖、分化和毛囊隆突部位以下细胞的周期性爆发式的凋亡密切相关[11]。
3.2 本研究表明,正常对照组和AGA患者非脱发区枕部毛囊干细胞增殖率要明显高于脱发过渡区和脱发区，说明AGA患者，毛囊干细胞增殖活性在一定程度上受到抑制。国外Mobini N等[7]研究发现，在扁平苔癣引起的脱发患者中，也发现处于增殖的毛囊干细胞数量明显减少，并认为这可能是引起脱发的原因；国内学者邢书亮等[12]报道，在脂溢性脱发患者的脱发区，其毛囊干细胞数量减少；但国外Luis A.G等[13]研究发现,AGA患者毛囊干细胞数量并没有减少,引起其脱发的是具有分化为毛囊能力的CD-200和CD-34阳性的毛囊干细胞数量减少。因此,笔者认为男性AGA患者,由于毛囊干细胞增殖活性的下降,可能导致具有分化毛囊的毛囊干细胞数量减少，是引起AGA脱发的可能原因。至于为何引起脱发区和脱发交界区毛囊干细胞增殖活性下降,原因不清楚,笔者认为可能与这些部位的毛囊干细胞生存的微环境受影响有关,研究发现, AGA患者中，脱发区毛囊具有轻度慢性炎症及其周围的纤维化[14],这可能影响到毛囊干细胞生存的微环境。
3.3 本研究还发现，不论是正常对照组，还是AGA患者不同头皮区域的毛囊中均未见到有CK15阳性的毛囊干细胞中有TUNEL阳性的细胞，这说明，在AGA患者中，脱发的机制可能与毛囊干细胞的凋亡无关。此外，笔者也发现，在各个毛囊组织中，存在数量不等TUNEL阳性细胞，各组毛囊的TUNEL阳性细胞率间无显著性差异，TUNEL阳性细胞主要散在分布于毛囊中段以上的内毛根鞘，这与Prieto等[9]报道的结果基本一致，但与Cowper 等[10]研究的结果存在差异；至于其原因，笔者认为可能与人种、病情严重程度等有关。
总之，本研究结果表明，AGA患者中，脱发区和交界区毛囊干细胞存在增殖活性下降，没有发现毛囊干细胞凋亡现象。毛囊干细胞增殖活性下降的机制及其是否参与AGA脱发的过程，值得进一步研究。
[参考文献]
[1]王磊,范卫新,曹蕾,等.脱发患者生活质量调查[J].临床皮肤科杂志,2008,37(7):417-419.
[2]Akiyama M,Smith LT,Shimizu H. Changing patterns of localization of putative stem cells in developing human hair follicles[J] ......
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