EGFP和CM-Dil示踪骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的体内研究(3)
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GFP已广泛用于蛋白质、细胞器的标记及基因表达的研究[12-14]，其突变体EGFP的荧光强度是野生型的35倍。CM-Dil是亲脂性荧光染料，嵌入细胞膜从而标记整个细胞[15]，近年来逐渐用于细胞移植的示踪研究，具有使用简便、染色快速、荧光衰减慢、标记效率高等优点[16-19]。本实验中EGFP、CM-Dil标记BMSCs的效率在80% 以上，而且细胞标记后增殖能力未受明显影响，植入体内仍具有成骨活性。通过免疫组化和荧光观察示踪细胞发现，植入4周后标记效果仍显著，随着时间延长，被标记的细胞数量逐渐减少，到12周少量BMSCs存活，大部分已被机体自身细胞取代，说明植入的BMSCs进行着和机体自身细胞相同的生命活动，从增殖分化为终末细胞发挥生理功能，到最终走向死亡，在这一过程中BMSCs不仅能分化为成骨细胞，而且可能通过旁分泌、自分泌等作用，分泌SDF-1、VEGF等细胞因子，发挥趋化、诱导分化机体自身细胞等功能，最终机体自身细胞取代BMSCs，形成新生骨组织。
本实验分别应用EGFP和CM-Dil标记示踪BMSCs，为探讨种子细胞在体内的转归寻找有效的标记方法。结合两种标记方法，发现部分BMSCs至少能存活12周以上，也证实了早期骨生成过程中种子细胞起到重要作用。比较两种标记方法，EGFP需经过质粒构建、病毒转染、病毒液提取和滴度测定等步骤，且标本要用免疫组织化学方法检测，操作复杂；而CM-Dil标记操作和检测虽然相对简单，但CM-Dil会随着细胞分裂导致细胞膜染料减少、荧光衰减[20]，此外骨组织钙盐沉积也给荧光检测带来了不便。因此，为探讨种子细胞在组织工程骨形成中的作用及转归，需进一步寻找和优化标记方法。
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