芦荟多糖对脊髓缺血损伤的神经保护作用(2)
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1.2 实验动物分组：32只成年雄性新西兰大白兔，体重2～2.5kg，随机分成4组(n=8)：即对照组(C组)、芦荟多糖组(A组)、溶剂对照组( V组 ) 及假手术组(S组)。A组在脊髓缺血前30min经耳缘静脉给予50m·kg-1芦荟多糖；V组以同样方式给予等容量生理盐水；C组仅仅制备脊髓缺血损伤模型，不进行其它处理；S组仅仅暴露腹主动脉，而不阻断它，其它处理同C组。
1.3 动物模型制作：所有动物术前禁食过夜，自由饮水。参照文献[4]的方法制作兔脊髓缺血模型。即静脉注射30mg·kg-1戊巴比妥钠麻醉动物后，经面罩吸入4L·min-1氧气，分别经耳动脉及股动脉置管以监测近端动脉压及远端动脉压；普鲁卡因局麻开腹，暴露腹主动脉左肾动脉分支下段；于左肾动脉分支点以下1.0cm处，放一环扎装置，用于阻断腹主动脉血流造成脊髓缺血。缺血前经耳缘静脉给予400U肝素。扎闭腹主动脉20min后去除环扎装置，恢复血流灌注。检查血管无损伤后关腹。术中持续监测心率、动脉血压及直肠温度。用烤灯维持动物体温37.5℃～38.5℃。分别于扎闭前即刻、扎闭后10min和再灌注后20min经兔耳动脉采血监测PaO2、PaCO2及血糖。
1.4 神经功能评分：在缺血再灌注后48h由一不了解分组情况的观察者对动物后肢运动神经功能评分。评分参照Tarlov[5]标准，分为五级：O分,后肢完全瘫痪；1分，后肢有微弱运动；2分，后肢可运动，但无法站立或跳跃；3分，可站立或跳跃，但有明显共济失调；4分，后肢运动功能完全恢复。
1.5 组织病理学观察：神经功能评分完毕后，用戊巴比妥钠30mg·kg-1麻醉动物后，以40g·L-1多聚甲醛经心灌注固定脊髓组织，取腰段脊髓组织(L5-L7)，行石腊包埋后切片(6μm厚)，HE染色，光镜下(400×)由一不了解分组情况的观察者观察脊髓病理学改变并对脊髓前角正常运动神经元计数。损伤及坏死神经元表现为胞核固缩或溶解，胞质呈嗜伊红染色，胞质中尼氏体消失；正常神经元表现为多角形结构，胞核结构清晰，胞质中尼氏体存在。病理损伤程度通过计数脊髓前角 (沿中央导水管横线以前 )正常神经元数来评估。每只动物脊髓前角正常神经元计数为 3张切片计数的均数。
1.6 统计处理：所有生理学参数以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用随机单位组方差分析；神经功能评分和脊髓前角正常神经细胞计数各组间比较采用非参数的秩和检验(Kruskal-Wallis test), 然后用 Mann-whitney U检验进行比较，显著性水准需用比较次数校正。神经功能评分及脊髓前角正常神经元数之间的相关性分析采用Spearman等级相关分析。
2 结果
2.1 生理学参数：各生理学参数各时间点组间无明显差异 (P>0.05, 表1)。
2.2 神经功能评分：A组的神经功能评分明显高于C组及V组(P<0.01)；C组及V组的神经功能评分组间无明显差异(P>0.05), (图1)。
2.3 组织病理学观察：A组的脊髓前角正常神经细胞数明显高于C组及V组(P<0.01)；C组及V组的脊髓前角正常神经细胞数组间无明显差异(P>0.05)(图2)。C组及V组几乎未见到前角运动神经细胞，脊髓损伤严重，有大量的空泡变性；A组可观察到形态基本正常的前角运动神经细胞，结构完整，核仁清晰，可见尼氏体；S组为形态正常的前角运动神经细胞(图3)。
2.4 神经功能评分与脊髓前角正常神经细胞数之间的相关性：分析再灌注48h后神经功能评分与其对应脊髓前角正常神经细胞计数之间的关系，发现两者之间有显著的相关性(r=0.804，P<0.01)。
3 讨论
3.1 脊髓缺血损伤及其导致的截瘫是降主动脉和胸、腹主动脉手术后的严重并发症，这些手术术后即刻或术后数小时可能出现明显的神经功能障碍，从而影响手术效果并给患者造成巨大的心理和经济负担。虽然用大量的外科方法和药物干预去阻止术后并发症的发生，但目前仍无一种方法能完全阻止术后截瘫的发生[6]。在临床上，甾体类药物(比如：甲基强的松龙)仍是防护脊髓缺血损伤的最有效的药物之一，但是这些甾体激素的副作用问题也比较严重(比如：肺炎和败血症)，限制了它们的临床应用[7]。因此，寻找神经保护效果好、副作用少的神经保护药物仍是一项重要的任务。
3.2 芦荟多糖(Aloe polysaceharide，AP)是芦荟凝胶部分除去水分以外的主要成分，约占芦荟凝胶总固体的60%以上。AP是芦荟的主要活性物质之一，其化学组成及药理作用日益受到广泛重视。已有的研究显示，AP基本结构是由线性的β-(1，4)-D-甘露糖基单元组成的一种长链聚合物[8]，不同品种芦荟中组成多糖的单糖种类及其摩尔比不同，但都显示较好的促进皮肤创伤愈合、延缓皮肤衰老、促进成纤维细胞生长、抗感染、抗辐射、降血糖、抗肿瘤和调节免疫等多种药理作用[9]。近年来，发现AP对体外培养的PC12细胞具有保护作用[2]，提示AP可能具有成为新型神经保护药的潜在价值。
3.3 本次实验的结果证实，AP能对20min脊髓缺血产生明显的保护作用。与对照组和溶剂组相比，AP组的神经功能有明显改善，再灌注48h后对照组有5只兔后肢完全瘫痪，而AP组没有一只兔后肢完全瘫痪，后肢均能站立或明显运动。组织病理学结果进一步证实AP能减少脊髓前角神经元的变性和坏死。AP组兔脊髓损伤较轻，而对照组和溶剂组兔脊髓有较严重的损伤，表现为组织坏死、核周质肿胀、前角运动神经元空泡变性、尼氏体消失及核溶解。这说明AP对兔脊髓缺血损伤有显著的神经保护作用。
3.4 本次试验没有探讨AP神经保护作用机制，以往的研究证实AP具有显著的抗脂质过氧化和清除自由基的作用[10]；具有明显的降低血糖的作用和调节免疫作用[11]，AP的上述药理学作用可能都参与了其神经保护作用，具体的神经保护机制还有待进一步的实验证实。
3.5 兔脊髓缺血再灌注损伤后，其后肢运动功能的恢复程度受多种因素的影响，如：温度、血糖、血压及血气等，本实验中，这些因素无统计学差异，因此可以排除这些因素的影响。虽然AP对兔脊髓缺血有较好的神经保护作用，然而在临床上还未得到检验，是否对人脊髓缺血有较好的神经保护作用，还有待进一步的深入研究 ......
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