富血小板纤维蛋白体外释放VEGF影响因素的探讨(2)
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1.3 方法
1.3.1 PRF制备
采血：取6月龄家兔，体重约3～4 kg，将未经麻醉的家兔固定后呈倒立位，分别从十只家兔耳中动脉迅速采血约20ml，用塑料和玻璃离心管分别收集血液，立刻在3000r/min条件下，离心10min[1]，见图1，离心后管内成分分为三层，最上一层为PRF上清液，中间一层为PRF凝胶，最下一层为红细胞层，玻璃管分层比较明显，而塑料离心管PRF上清不甚明显，见图2。从管内取出PRF凝胶后剪去底层红色部分，用双层无菌纱布挤压吸去多余液体[1]，制备成PRF膜片图3。
1.3.2 PRF释放VEGF样本收集：根据PRF不同的影响因素(材质和温度)，将PRF膜片分别置于37℃和4℃并于七个不同时间点分别收集样本[7]，即20min，4h，24h (day1)，72h (day3)，120h (day5)，and 168h (day7)，0-7day。
1.3.2.1 PRF上清液收集：制备PRF膜片前，先用5ml无菌的一次性注射器将各组PRF上清液收集到10ml无菌离心管内，并保存于-20℃冰箱内待测。
1.3.2.2 PRF膜片释放VEGF标本收集：PRF膜片分别置于无菌离心管内并加入4ml无菌DMEM培养液，然后在不同时间点，将每组PRF膜片转移到新的离心管内并加入4ml无菌DMEM培养液，并将之前管内4mlDMEM培养液放入-20℃条件下保存待测[7]。
1.3.3 血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒检测及数据收集：将所收集的样本按照ELISA试剂盒说明检测，用酶联免疫检测仪在450nm处测吸光值。根据样品OD值用Curve Expert 1.4软件计算相应VEGF含量，然后根据所检测的VEGF浓度计算每个PRF膜片整个周期(0-168h)所释放的VEGF总量，VEGF总量=各时间点浓度(pg/ml)总和×4，然后根据各组VEGF总量结果比较不同材质和温度制备的PRF对释放VEGF的影响。
1.3.4 统计分析：采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析。资料采用配对t检验比较两组之间的差别，P<0.05，差异有统计学意义。
2 结果
2.1 本实验结果显示PRF在整个周期中持续释放VEGF，但每个时间点所释放的VEGF的速度有所不同，前4h释放的速度较快，4h～1天维持在较高水平，1～3天进而放缓，3～5天释放略显缓慢，5～7天仍持续释放但速度较慢且释放的量较少，0～168h较低，见图4。
2.2 玻璃管与塑料管制备PRF对释放VEGF含量比较：实验结果表明对于玻璃离心管制备的PRF，其持续一周释放的VEGF含量高于塑料离心管制备的，见图5，两者比较有显著统计意义(P<0.05)。
2.2 不同温度对PRF释放VEGF含量的比较：本实验结果显示保存于4℃的PRF膜片所释放的VEGF含量高于保存在37℃的，两者比较具有显著统计意义(P<0.05)。
2.3 PRF上清液与PRF各时间点释放VEGF含量比较：本实验结果同样显示所制备的PRF上清液中，也含少量的VEGF，相对PRF各时间点所释放的量略少，见图7。
3 讨论
3.1 目前国内相关文献报道中对PRF特性的研究尚不多见，尤其是对其制备方法和相关影响因素方面的研究。由于科研实验或临床中手术程序等原因，PRF在制备后一般未能即刻应用，因此需要暂时储存于合适条件下以待用。目前国内外文献报道中未见提及不同储存温度是否对PRF的特性存在一定影响，同时对于PRF的制备所用的离心管材质是否对PRF特性有影响等方面的研究也尚未有详细的相关报道，因此本研究通过采用不同材质的离心管制备PRF和不同的储藏温度是否对PRF释放相关生长因子存在影响方面入手，探讨其相关生物学特性。
3.2 本实验通过采用不同材质的离心管制备PRF以及保存于不同温度来检测其对释放VEGF的含量变化，其对VEGF释放的总体规律与国外研究结果相符[7]，本实验结果显示PRF能持续释放VEGF一周以上，但每个时间点所释放的VEGF的速度有所不同，同时发现不同材质的离心管和不同的保存温度对PRF的生物学特性存在一定的影响，玻璃离心管制备的PRF以及保存于4℃的PRF所释放的VEGF含量略高于塑料管制备的PRF以及保存于37℃的PRF，但这两者存在差异的具体影响因素有待进一步研究探讨。因此在制备PRF之前应采用合适的离心管和合适的保存温度，以免影响相关生长因子的作用。本实验中0～168h检测的PRF含量相对较低，其可能原因是释放的生长因子存在一定的衰减作用，因此也应考虑PRF制备后的保存时间问题，PRF制备好之后不宜存放太长时间，若长时间不能马上使用应置于低温保存，但具体的合适温度和最佳使用时间有待进一步研究。本实验通过对PRF的上清液释放VEGF的检测中发现，PRF上清液也存在一定的相关生长因子，与相关文献报道一致[8]，其含量相对PRF膜片略显偏低，但仍然具有一定的应用价值，因此在临床应用或是基础研究中不应忽视。
3.3 PRF作为近年来的研究热点，但对其相关特性和影响因素尚未明确，有研究表明PRF能促进多种细胞的增殖、分化和再生能力[9]等。目前PRF在口腔种植领域的应用已初步取得成效[3-4]，有研究显示PRF在口腔软硬组织的创伤修复中，起到了较明显的促进作用[10-11]，同时Liao等[12]利用PRF复合骨髓间充质干细胞用于下颌骨的重建术表明，PRF作为新的二代富含血小板生物材料具有促进骨再生的潜能。本课题组前期实验中利用PRF和ASCs复合自体脂肪颗粒进行的自体脂肪移植，结果也提示PRF能够显著提高移植脂肪组织的成活率，因此利用PRF复合相关基质或干细胞在未来整形美容领域具有较大的应用前景和价值。本实验通过采用不同材质的离心管和不同的保存温度比较PRF和PRF上清液释放VEGF含量变化的特性 ......
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