阿司匹林对正常人表皮黑素细胞系PIG1细胞黑素生成的影响(2)
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1.2.4 阿司匹林对PIG1细胞黑素生成影响的测定[2]：采用NaOH裂解法，取对数生长期细胞，常规消化离心后，调节细胞浓度至5×105/ml，接种及分组同上。阿司匹林处理72h后，吸去上清，用1×PBS洗2次，每孔加入100μl浓度为1M的NaOH溶液，37℃水浴1h，酶联免疫分析仪测定450nm波长的吸光度值(A)。阿司匹林处理组相对黑素含量=(A阿司匹林组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。
1.2.5 阿司匹林对PIG1细胞酪氨酸酶活性影响的测定：采用体外DOPA氧化反应法,细胞接种方法和分组同黑素含量测定。阿司匹林处理72h后，吸去上清，用1×PBS洗2次，每孔加入90μl浓度为1%的TritonX-100溶液，迅速置于-80℃冰箱内冻存30min，室温下融化使细胞完全裂解。每孔加入100μl浓度为0.1%的L-DOPA(1×PBS配制)溶液，37℃孵育2h，酶联免疫分析仪测定490nm波长的吸光度值(A)。阿司匹林处理组相对酪氨酸酶活性=(A阿司匹林组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。
1.3 统计学分析：数据以x±s表示，利用SPSS12.0进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 阿司匹林对PIG1细胞形态及细胞活力的影响：阿司匹林浓度在62.5～500μM时，PIG1细胞形态与对照组相比，无明显差异。阿司匹林浓度大于1000μM时，细胞树突变短，胞体肥大。细胞活力检测结果为阿司匹林在浓度小于或等于500μM时，细胞活力与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。阿司匹林浓度大于或者等于1000μM时，细胞活力以剂量依赖方式降低，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1、2)。
2.2 阿司匹林对PIG1细胞黑素生成的影响：阿司匹林在62.5～500μM浓度范围内，以浓度依赖方式降低黑素生成量，其中125μM 、250μM、500μM阿司匹林处理组黑素生成量的降低具有统计学意义(P<0.05)(表1)。
2.3 阿司匹林对PIG1细胞酪氨酸酶活性的影响：阿司匹林在62.5～500μM浓度范围内，酪氨酸酶活性与对照组相比，无明显差异(P>0.05)(表2)。
3 讨论
3.1 一直以来，色素增多性疾病如炎症性色素沉着、黄褐斑等都是困扰皮肤科医师的难题。如何在不杀伤黑素细胞的情况下降低黑素合成一直是研究者不断探索的治疗方法。近年来，从植物中提取的具有抗氧化性质的活性成分，如姜黄素[2]、茶黄素[7]、槲黄素[8]、莱菔硫烷[9]等，被证实具有抑制黑素生成的作用。阿司匹林最初来源于柳树，同样发现其具有清除自由基及抗氧化作用[3-4]，因此我们研究了阿司匹林对黑素细胞黑素生成及酪氨酸酶活性的影响。
3.2 本实验中，通过对正常人表皮黑素细胞系PIG1细胞的培养，我们观察到浓度在62.5～500μM之间的阿司匹林对黑素细胞无明显毒性，降低了黑素生成量，但是对酪氨酸酶活性无显著影响。之前Sato K等[5]发现2mM阿司匹林作用5天后，小鼠B16黑素瘤细胞的黑素生成量显著降低，酪氨酸酶蛋白量显著降低，但是体外酪氨酸酶活性无显著变化，与本实验结果基本一致，有些差异可能由于细胞系不同或体外实验误差导致。研究显示大多数药物是通过抑制酪氨酸酶活性来抑制黑素生成[2,8- 9]，但是酪氨酸羟基化形成多巴与多巴氧化形成多巴醌最终生成黑素的一系列反应过程中，涉及多种信号通路，如腺苷酸环化酶/cAMP-依赖蛋白激酶通路、MAP激酶通路、PI激酶/p70SG激酶通路、PKC依赖通路[10]，除了主要的调控因素酪氨酸酶，相关的调控或影响因素还有Pmel基因家族、内皮素、过氧化物酶、多巴醌及转录因子MITF[10-11]，因此阿司匹林可能通过其他途径抑制黑素生成，如可通过抑制COX或NF-κB等影响某个信号通路，导致黑素生成或转运过程中某个步骤改变，或者通过清除自由基改变黑素生成反应中的氧化还原反应，导致不同类型黑素颗粒或者黑素前物质比例改变，进而影响了黑素的生成量。因此，明确阿司匹林对黑素生成的具体影响机制，还需要进行深入的研究来证实。
3.3 阿司匹林临床应用广泛，具有价格实惠、安全性强以及较易推广的特点。临床上有经验显示非甾体类抗炎药治疗炎症后色素沉着有良好疗效，也有研究显示局部应用前列腺素E2、F2α及类似物增加毛发生长和黑素生成[5]。因此，阿司匹林应用于色素增多性疾病的治疗具有良好的前景。同时，阿司匹林对黑素生成的研究将为其治疗色素增多性疾病提供实验依据，为其进一步推广奠定基础。
[参考文献]
[1]Mastore M,Kohler L,Nappi AJ.Production and utilization of hydrogen peroxide associated with melanogenesis and tyosinase-mediated oxidation of DOPA and dopamine[J].FEBS J,2005, 272(10):2407-2415.
[2]林 茂,卢姗姗,齐晓怡,等. 姜黄素对正常人表皮黑素细胞黑素生成的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2011,10(1):5-7.
[3]Shi X, Ding M, Dong Z, et al. Antioxidant properties of aspirin: characterization of the ability of aspirin to inhibit silica-induced lipid peroxidation, DNA damage,NF-kappaB activation,and TNF-alpha production[J]. Mol Cell Biochem,1999,199(1-2):93-102.
[4]Podhaisky HP,Abate A,Polte T,et al. Aspirin protects endothelial cells from oxidative stress--possible synergism with vitamin E[J]. FEBS Lett,1997,417(3):349-351.
[5]Sato K,Takahashi H,Iraha R,et al ......
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