当归水煎液对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及胶原合成的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
1.2.4 细胞增殖检测：用噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)染色法检测细胞增殖。内皮细胞悬液(1×105个/ml)接种于96孔培养板，80%DMEM+20%FBS的培养液37℃ 5%CO2饱和湿度培养24h后，按分组给药，继续培养48h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，弃去培养液，加入DMSO 150μl/孔，振荡10min，使结晶物充分溶解。酶标仪上490nm波长下测各孔光吸收值(OD)，每组8复孔。试验重复2次。按下列公式计算促增殖率：促增殖率＝(当归组OD值-对照组OD值)∕(对照组OD值-培养液组OD值)×100%。
1.2.5 细胞周期及凋亡检测：用流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测细胞周期及凋亡。取对数生长期的内皮细胞，不含胎牛血清的DMEM培养24h后，分别加入不同浓度当归水煎液的DMEM培养48h。对照组加等体积的DMEM。常规消化离心细胞，PBS洗3次，以预冷的70%乙醇4℃固定过夜，RNA酶37℃消化30min，碘化丙啶(PI)染色后上流式细胞仪检测各组细胞中DNA，每个样品至少测定10 000个细胞以上。试验重复2次。
1.2.6 胶原合成测定：用放射免疫法测定培养上清液中的Ⅲ型前胶原。取融合生长良好的内皮细胞，不含胎牛血清的DMEM培养24h后，分别加入不同浓度当归水煎液的DMEM培养48h。对照组加等体积的DMEM。分别于12h、24h、48h后吸取培养上清液，-20℃保存，2周内检测。
采用Ⅲ型前胶原氨端肽(PⅢNP)放射免疫分析盒检测Ⅲ型胶原纤维的合成。检测时，于1.5ml离心管中加入上清液100μl和兔PⅢNP抗体200μl，4℃放置20h，加125I-PⅢNP100μl，充分摇匀4℃放置4h，加驴抗兔免疫分离剂500μl，充分摇匀，室温放置20min，4000r/min离心30min，吸弃上清液，在γ计数器测定各个沉淀管的放射活性。重复测定2次，取平均值。
1.2.7 统计学处理：计量资料以均数±标准差表示。用单因素方差分析比较组间差异显著性。应用SPSS10.0 软件包处理。P<0.05 为差异有显著性。
2 结果
2.1 不同浓度的当归水煎液对HUVEC生长的影响：随着培养时间延长，各组均显示出不同程度的促生长效应。1 600mg/L的当归水煎液促生长效应最明显，见图1。
2.2 不同浓度的当归水煎液对HUVEC增殖的影响：各组均有促增殖作用，随着浓度增大促增殖效果愈加明显，见表1。
2.3 不同浓度的当归水煎液对HUVEC周期和凋亡的影响：给予不同浓度的当归水煎液干预后，HUVEC周期各时相的细胞数占细胞总数的百分比与对照组比较有明显的不同，S 期和G2/M期细胞增多， G0/G1期细胞减少，提示当归水煎液浓度增大可促进内皮细胞DNA的合成，加快细胞增殖(P<0.05)，凋亡率逐渐减小，见表2。
2.4 不同浓度的当归水煎液对HUVEC胶原合成影响：随当归水煎液浓度增加和作用时间延长，当归水煎液对HUVEC培养上清液PⅢNP的浓度呈抑制作用(P<0.05)，见表3。
3 讨论
创伤愈合过程中血管内皮细胞具有重要作用。创伤后形成的肉芽组织的主要成分是成纤维细胞和毛细血管，新生的毛细血管则是由邻近毛细血管内皮细胞分裂增生演变而来。血管内皮细胞功能与血管内皮生长因子(VEGF)密切相关，VEGF是一种强效的血管生成促进因子，具有强烈的促进内皮细胞增殖作用，能增加细胞外基质合成和促进血管生成。当归促进HUVEC增殖，其机理可能是促进内皮细胞上VEGF的高表达[8]、增加内皮细胞周期中的S期和G2/M期而发挥作用。
中药当归为伞形科植物当归的根，有活血化瘀、软坚散结等功效。当归活性成分分为挥发油和水溶性两大部分，挥发油主要为抑制性成分，水溶性部分为兴奋性成分[9-11]。王保华[12]报道当归水煎液及其主要成分阿魏酸钠能促进内皮细胞增殖。我们的实验验证了上述观点，并发现当归水煎液促进内皮细胞增殖随浓度的增大而增强。
我们发现当归水煎液可剂量依赖性及时间依从性地抑制HUVEC合成胶原。有实验表明当归注射液能拮抗大鼠气管内注入博莱霉素诱导的肺纤维化[13]，可显著降低四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型的血清Ⅲ型前胶原水平[14]，可抑制成纤维细胞合成胶原[15]。这些结果均支持当归水煎液可用于防治增生性瘢痕。当归水煎液抑制HUVEC胶原合成的机制可能以下两个方面：①可能与其能有效抑制胶原蛋白交联、透明质酸解聚和脂质过氧化[16]；②通过降低TGFβ1表达来抑制胶原合成[17]。
本次实验以人HUVEC为靶细胞，证明当归水煎液可以促进HUVECB的增殖、抑制细胞凋亡及胶原合成从而发挥抗纤维化的作用。为当归治疗增生性瘢痕(HS)提供了实验基础。
[参考文献]
[1]Majno G.Chronic inflammation:link with angiogenesis and wound healing[J]. Am J Pathol,1998,153:1035-1039.
[2]吴国东,周慧君.青蒿琥酯诱导人脐静脉内皮细胞凋亡[J].中国药理学与毒理学杂,2004,18(4):294-299.
[3]张琳西,郭树忠,夏文森,等.血管内皮细胞对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响[J].中华整形外科杂志,2002,18(6):338-339.
[4]刘凯,张选奋,张瑾,等.当归挥发油对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及Ⅲ型胶原合成的影响[J].中华整形外科杂志,2007,23(3):248-250.
[5]Jaffe EA.Culture of human endothelial cells[J].Transplant Proc,1980,12(3 suppl1):49-53.
[6]Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by morphologic and immunologic criteria[J]. J Clin Invest,1973,52(11):2745-2756.
[7]Bachetti T,Morbidelli L.Endothelial cells in culture:a model for studying vascular functions[J] ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2314kb)。