局部miR—126基因治疗促进小鼠缺血后肢血管新生的观察(1)
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[摘要]目的：通过体外构建重组腺病毒miR-126，应用于小鼠缺血后肢腓肠肌局部治疗，观察miR-126对缺血局部具有促血管新生作用。方法：重组腺病毒miR-126包装 、纯化、滴度的鉴定；C57小鼠随机分为A组(C57左侧缺血后肢手术组)、B组(空病毒C57左侧缺血后肢手术组)、C组(重组腺病毒miR-126 C57左侧缺血后肢手术组)三组，制作小鼠缺血后肢模型，术后即刻将重组腺病毒miR-126和腺病毒各50μl局部注射于小鼠缺血左后肢腓肠肌。分别于3、7、14天各组(3只)取左后肢腓肠肌做HE染色、CD31免疫组化染色、western blot检测Akt、ERK1/2、pAkt、pERK1/2蛋白水平以及实时定量PCR检测等。结果：各种检测结果显示C组较A、B两组血管内皮细胞增生明显，新生血管数目计数明显增多，miR-126表达水平明显增高，尤其在第7天升高最为明显，以及VEGF、bFGF等介导的IP3和MAPK信号通路中ERK1、pERK1、AKT和 pAKT蛋白水平表达明显增高。结论：miR-126局部应用于缺血后肢，通过激活Akt、ERK1/2的相关通路，促进血管新生，利于缺血后肢功能恢复。
[关键词]miR-126；缺血后肢；血管新生；Akt；ERK1/2；
[中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2012)10-0-0
microRNA是新近发现的一类长约19-25个核苷酸的内源性微小RNA，通过与靶mRNA的5'或3'端的非编码区互补结合而使靶mRNA翻译抑制或降解[1]。 miR-126位于染色体9q34.3的宿主基因Egfl7(上皮生长因子-7)[2]，在内皮细胞中特异性高表达，调节内皮细胞生物功能的诸多方面，包括内皮细胞的增殖、迁移、细胞骨架的形成、毛细血管网的稳定以及细胞的存活等等，表明它是活体中维持功能性血管结构的前提，对血管新生起着至关重要的作用，展示了良好的应用前景[3-4]。
本实验通过体外构建重组腺病毒miR-126，局部应用于小鼠缺血后肢，观察其在局部表达情况的变化，以及促缺血局部血管新生的作用，从而及早、有效的促进缺血后肢功能的恢复情况，探索miR-126基因治疗在临床上应用的可行性。
1 材料
1.1 实验动物：C57小鼠，雌性，12周，购于第四军医大学实验动物中心。
1.2 仪器：显微外科手术器械、显微外科显微镜、酶标仪、电泳电源、电泳器材、转膜电源、半干转器材、滚筒架、发光仪、荧光定量PCR仪、凝胶成像系统(美国UVP)、水平电泳槽、超净工作台、干燥消毒烤箱、紫外分光光度计、台式离心机、低温高速离心机。
1.3 试剂：CD31抗体(Abcam)、二抗(Elvision法)、DAB显色液、裂解液、ERK1/2抗体、、AKT抗体、pERK1/2抗体、pAKT抗体、转膜液、发光液(Santa Cruz)、丽春红染料、封闭液、NC膜、电泳液、SDS凝胶试剂、GADPH、RT-PCR引物合成 (ABI，北京)、RNasin (Promega，美国)、M-MLV (Promega，美国)、SYBRR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)。
2 方法
2.1 重组腺病毒miRNA-126包装 、纯化、滴度的鉴定：根据mus-mir-126 的基因信息， 设计上、下游引物如下：
以小鼠基因组DNA为模板扩增mus-mir-126 基因；全基因合成mus-mir-126 基因至PES 载体上；小鼠mus-mir-126基因克隆至pacAd5 CMV-IRES-GFP 载体上；质粒扩增、鉴定及线性化；重组腺病毒的包装；用滴定法测定重组腺病毒滴度。
2.2 实验动物分组：C57小鼠随机分为3组，每组12只：A组、C57左侧缺血后肢手术组；B组、空病毒C57左侧缺血后肢手术组；C组、重组腺病毒miRNA-126 C57左侧缺血后肢手术组。
2.3 C57小鼠左后肢缺血模型的构建：在显微外科镜下，小鼠左侧腹股沟处暴露股动脉深、浅支，近、远端结扎，中间离断，缝合伤口。
2.4 给药方法：空病毒组、重组腺病毒miRNA-126组用1ml注射器对左后肢腓肠肌局部注射，滴度为1×109OPU/ml，各50μl，按组分笼喂养。
2.5 检测指标：
2.5.1 大体观察：各组0～14天末梢血运状况的观察。
2.5.2 组织学检测：7天、14天分别取左后肢腓肠肌组织，进行HE 染色、血管内皮细胞的CD31 染色，计算血管数目、密度。
2.5.2.1 石蜡切片常规HE染色。
2.5.2.2 CD31染色(Elivision法)：选取5μm厚的石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，压力锅进行抗原修复，灭活内源性过氧化物酶30min，10%山羊血清封闭液37℃温育15min，PBS冲洗，滴加稀释兔抗鼠CD31一抗(Abcam 1：250)4℃过夜，PBS冲洗，滴加二抗37℃温育30min，冲洗、滴加新鲜配制的DAB显色液，苏木素复染，中性树胶封片，阅片。
2.5.3 实时定量PCR检测：各组C57小鼠第3、7、14天处死(各组每次3只小鼠)，取左后肢腓肠肌组织做miR-126基因水平检测。RNA的提取；实时定量荧光PCR反应上下游引物设计；取5ug RNA运用Promega MMLV逆转录酶及相关试剂进行逆转录反应 ......
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