大麻素受体CB2在机械牵张力介导的人牙周膜细胞成骨分化中的作用(1)
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[摘要]目的：研究大麻素II型受体(cannabinoid receptor II， CB2)在机械牵张力介导的人牙周膜细胞中的表达以及成骨分化中的作用。方法：体外培养人牙周膜细胞，构建细胞-机械牵张力加载模型，施加不同大小的机械牵张力，采用Real-time PCR和细胞免疫荧光化学技术检测CB2在人牙周膜细胞中mRNA和蛋白的表达。用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测机械牵张力介导的细胞ALP活性。结果：对人牙周膜细胞施加不同大小的机械牵张力24h，CB2 mRNA的表达随机械牵张力的力值增大而显著性增加(P<0.05)，在18%拉伸应变率作用下表达量最高(P<0.05)，此时CB2蛋白的表达显著增加。加入CB2激动剂HU-308后，施加18%拉伸应变率的机械牵张力作用于人牙周膜细胞24h，ALP活性显著性增加(P<0.05)。结论：CB2在人牙周膜细胞中的表达与机械牵张力的力值具有相关性。在机械牵张力作用下，大麻素受体CB2与其配体结合能够促进人牙周膜细胞的成骨分化，从而在正畸牙槽骨改建中发挥重要作用。
[关键词]大麻素II型受体；机械牵张力；成骨分化；牙周膜细胞
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2012)10-0-0
正畸治疗中，矫治器所施加的机械力首先作用于牙齿，然后传导至牙周膜，牙齿一侧的牙周膜受到牵张力，牙槽骨形成；另一侧牙周膜受到压力，牙槽骨吸收，从而发生牙槽骨改建，使错位的牙齿在牙槽骨内发生移动，到达正常位置[1-2]。牙周膜细胞是机械力的直接效应细胞，具有成骨样细胞表型，受到机械牵张力作用后首先发生成骨分化，进而形成牙槽骨，在正畸牙槽骨改建中发挥着极其重要的作用[3-4]。因此研究牙周膜细胞在机械牵张力作用下的成骨分化过程，对于深入了解正畸牙槽骨改建机制具有重要意义。但是，目前对于机械牵张力作用下牙周膜细胞发生成骨分化的机制仍未阐明。我们前期的研究证实：人牙周膜细胞表达大麻素II型受体(cannabinoid receptor II， CB2)，CB2与其配体(CB2激动剂)结合能够促进人牙周膜细胞的成骨分化[5]，这提示我们：CB2很可能参与了机械牵张力作用下人牙周膜细胞的成骨分化过程。本实验进一步研究CB2在机械牵张力介导的人牙周膜细胞成骨分化中的作用。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器：DMEM培养基 (Hyclone，美国)；胎牛血清 (FBS，Gibco，美国)；胰蛋白酶 (Gibco，美国)；FITC标记山羊抗兔IgG (Santa Cruz Biotechnology， 美国)；HU-308(Cayman Chemical， 美国)； SR144528(Cayman Chemical， 美国)；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒 (南京建成生物制品公司)；CO2细胞培养箱 (Forma Scientific，美国)；YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)；倒置相差显微镜及照像系统 (Olympus，日本)；Flexercell Strain Unit (Flexcell International，美国)；ABI 7500 Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems， 美国)。
1.2人牙周膜细胞的体外培养和鉴定：取11～14岁青少年因正畸拔除的牙周健康的双尖牙。采用组织块法原代培养人牙周膜细胞，取第2代细胞爬片，用免疫组化SP法进行波形丝蛋白和角蛋白染色，进行来源鉴定。证明细胞为间叶来源后，取第3～5代细胞用于实验。
1.3人牙周膜细胞的体外加力：采用细胞机械牵张力加载装置Flexercell Strain Unit，构建人牙周膜细胞-力学加载模型。对细胞加载24h的机械牵张力，力值分别为0%、6%、12%、18% 拉伸应变率，频率为6循环 / min，每循环包括5s拉伸，5s松弛。
1.4 Real-time PCR检测机械牵张力作用下CB2 mRNA在人牙周膜细胞中的表达
1.4.1 总RNA提取：在弹性培养皿中加入lml Trizol，吹散，收集细胞于1.5ml Ep管内，震荡30s后加入0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min，12 000g，4℃离心，l5min，吸上层无色水相，移入另一EP管中(约0.5ml)。加等体积异丙醇，-20℃，30min。12 000×g，4℃ 离心，10min。在管底部可见微量RNA 沉淀。弃上清，加75%乙醇lml，振荡。7 500×g，4℃ 离心，10min。弃上清，用滤纸吸取残留液体，室温干燥 5～10min。沉淀溶于20μl DEPC水，取1μl加入79μl DEPC水，测OD260/OD280计算浓度与纯度，-70℃保存。逆转录合成cDNA。
1.4.2 Real-time PCR实验：引物设计见表1，Real-time PCR 根据QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒手册进行。反应混合液(25L)预先在95℃放置l5min以激活热启动Taq酶，然后95℃变性30s，95℃退火5s，60℃延伸30s ......
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