重组腺相关病毒介导的IL—32基因抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的机制研究(2)
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参见附件。
1.2.7 蛋白质印迹检测rAAV2-IL-32感染KFs后的Bcl-2、BAX、TGF-β1的表达：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，收集细胞，PBS洗涤2次，加入裂解缓冲液，冰上放置30min。然后在4℃、15 000×g离心15min，收集样品并与上样缓冲液一起煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳；再将凝胶蛋白转印到硝酸纤维膜上，经5%脱脂奶粉封闭1h，加入一抗室温孵育2h，TBST缓冲液洗3次，再加入辣根过氧化酶标记的二抗孵育1h，ECL发光液作用1min后以化学发光凝胶成像系统扫描记录实验结果，并进行定量分析。
1.2.8 统计分析：实验数据采用SPSS15.0统计学软件分析，计量资料结果用均数±标准差(x±s)表示；两组间差异比较用t检验，三组间差异比较用方差分析和q检验。P>0.05差异无统计学意义，P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组腺相关病毒载体rAAV2-IL-32的病毒滴度测定(表1)，病毒滴度为 5.2×1011 v.g./ml。
2.2 IL-32在KFs中的表达
2.2.1 rAAV2-IL-32感染KFs后的荧光表达：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，荧光显微镜观察细胞，rAAV2-IL-32在感染复数(MOI)105时感染效率达50%以上(图2、3)。说明重组腺相关病毒转染成功，感染效率达到实验要求。
2.2.2 RT-PCR结果：rAAV2-IL-32感染KFs经RT-PCR验证在570bp处出现高表达电泳条带，而腺相关病毒空载体组则未出现电泳条带，表明rAAV2-IL-32在KFs中过表达(图4)。
2.3 rAAV2-IL-32对KFs增殖能力的影响：腺相关病毒空载体和rAAV2-IL-32按照不同的感染复数浓度感染KFs，72h后，用MTT检测方法分析KFs相对增殖率(图5)。结果显示：rAAV2-IL-32组比对照组细胞增殖率差异有显著性(P<0.05)，表明体外转染IL-32基因后可抑制KFs生长，且有浓度依赖性。
2.4 RT-PCR方法检测rAAV2-IL-32感染KFs后Bcl-2、BAX、TGF-β1的表达(表2)。
2.4.1 Bcl-2、TGF-β1的表达结果：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，结果显示： Bcl-2、TGF-β1在KF组的表达水平明显高于正常皮肤组(P<0.05)；Bcl-2、TGF-β1在KF-IL-32组的表达水平明显低于KF组和KF-EGFP组(P<0.05)，说明体外感染rAAV2-IL-32 能显著降低Bcl-2、TGF-β1在KFs中的表达水平。
2.4.2 BAX的表达结果：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，结果显示：BAX在KF组的表达水平明显低于正常皮肤组(P<0.05)；BAX在KF-IL-32组的表达水平明显高于KF组和KF-EGFP组(P<0.05)，说明体外感染rAAV2-IL-32能显著升高BAX在KFs中的表达水平。
2.5 蛋白质印迹检测rAAV2-IL-32感染KFs后Bcl-2、BAX、TGF-β1的表达：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，蛋白质印迹法检测显示Bcl-2、TGF-β1的表达水平降低，BAX的表达升高(图6)，表明体外感染rAAV2-IL-32可上调BAX蛋白的表达，同时下调Bcl-2、TGF-β1蛋白的表达。
3 讨论
近来许多研究表明，瘢痕疙瘩的形成可能与基因的结构、功能或表达异常有关，但其调控机制尚不明确。瘢痕疙瘩在临床表现及组织病理学改变等方面与良性肿瘤有某些相似之处，研究发现肿瘤相关基因及细胞因子在瘢痕疙瘩与正常皮肤中存在表达差异[6]，它们在瘢痕疙瘩的发生发展中起着重要作用。人IL-32基因定位于染色体16p13.3上，含有8个小外显子，跨长约5kb。人IL-32 mRNA长为1.2kb，在免疫组织中表达增强[7]。目前发现，IL-32一共有6种剪接变异体[11]：IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε和IL-32ζ蛋白。IL-32的主要生物学功能：①诱导产生炎症细胞因子[4]；②是重要的调节细胞增殖与凋亡的基因：在T细胞中，IL-32的大量表达可诱导细胞凋亡[8]；③在自身免疫性、炎症性疾病里起重要作用[9]：IL-32可诱导多种细胞因子的产生，同时与多种炎症性疾病密切相关；是一种前炎症反应细胞因子，与疾病的严重性程度相关，在适应性免疫应答和固有性免疫应答中发挥作用。
在瘢痕疙瘩组织中及体外培养的KFs中均发现了细胞增殖调控及细胞凋亡方面的异常 ......
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