缺血后处理激活自噬保护皮瓣机制研究(1)
[摘要]目的：缺血后处理皮瓣在临床上已经运用，开始相关研究探究缺血后处理对皮瓣保护机制。方法：健康成年新西兰大白兔，分为3组。A组为给予缺血后处理；B组为再灌注前5min给予自噬阻滞剂3-甲基腺嘌呤 10μl +缺血后处理。C组，直接应用微血管夹阻断腹壁浅血管持续缺。6h后再灌。各组分别进行自噬指标Beclin1、LC3 免疫组化和皮瓣存活率检测。结果：新西兰大白兔完全存活。B、C组相比较，自噬Beclin1、LC3 免疫组化染色阳性细胞面积变化未见统计学差别(P>0.005)。实验组皮瓣存活面积比较， B 与C相比较，无统计学意义(P>0.005)，但是A与B、C相比较，上述指标两两之间都有统计学意义差别(P<0.005)。结论：缺血后处理对皮瓣再灌注损伤有保护作用，该作用可能和自噬激活有关。
[关键词]皮瓣；缺血-再灌注损伤；自噬
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2013)02-0261-03
近年， 缺血再灌注损伤的防治逐渐成为众多学者关注的热点。自2004年zhao 等学者提出了缺血后处理概念， 并且通过一系列动物实验证实后处理具有心肌，肌肉等保护作用[1]。内皮细胞是皮瓣再灌注损伤的关键靶点之一。缺血后处理和血管内皮细胞保护有关[2]。最近研究发现缺血再灌注损伤中激活自噬有保护内皮细胞稳态的作用[3]。缺血后处理保护皮瓣作用是否和激活自噬有关，笔者将进行相关研究 以论证该假说。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立：选用健康成年新西兰大白兔24只， 雌雄不限， 体重2.5～3.5kg。以3%异戊巴比妥钠(1ml/kg)耳缘静脉注射，麻醉后以仰卧位固定，全腹部备皮后制取左侧腹股沟皮瓣约4cm×8cm，以腹壁浅血管为蒂，保留血管蒂。
1.2 实验方法与分组：24只大白兔模型建立后， 用随机数字表法平均分成3组，每组8只。对照组为C组，诱导再灌注损伤时首先微血管夹阻断腹壁浅血管缺血6h恢复正常血供；实验组持续缺血再灌注后按照前期的研究设定给予短暂缺血再灌注处理(10s缺血+10s再灌注为一个疗程，共6个疗程，持续2min)。按照自噬抑制剂使用的方式继续分为2组：A组为给予缺血后处理；B组为再灌注前5min给予腹壁浅静脉给予自噬抑制剂3一甲基腺嘌呤10μl缺血后处理。A，B组处理后实验步骤与对照组相同。在围实验期血管蒂注意保温防止痉挛。
1.3标本收集与检测：每组兔子恢复血流4h后， 取2只处死，甲醛固定皮瓣组织后HE染色下观察下观察。Abgent 公司的兔抗人微管相关蛋白轻链3(MAP1- LC3)多克隆抗体 ，Santa Cruz 公司的兔抗人自噬基因Beclin1 多克隆抗体。福建迈新生物制品公司的辣根过氧化酶标记山羊抗兔二抗体， DAB 显色。PBS 缓冲液代替一抗作为空白对照。以细胞胞浆棕黄染为阳性；显微数字图像分析系统采集、分析免疫组化结果。
其余6 只动物于术后1周判断皮瓣成活情况，计算皮瓣成活面积的百分比。
1.4 统计学方法：SPSS11.0行统计处理， 数据以均数±标准差(x±s)表示。实验组与对照组比较采用t检验，P<0.05 为有统计学意义
2 结果
2.1 大体观察：手术中和手术后1周内所有的新西兰大白兔均存活。皮瓣恢复灌注24h内， C组皮瓣远端大部分组织迅速肿胀淤紫，指压毛细血管反应消失，以后皮瓣两边逐渐发黑。术后7天坏死界限明确。A实验组皮瓣两侧边缘部分出现肿胀，色泽偏暗，指压毛细血管回流稍迟缓，一周后两侧皮瓣边缘部分失活。B，C组肉眼观察形态变化接近。
2.2皮瓣Beclin1、LC3免疫组化染色阳性细胞比较：B、C组相比较，Beclin1及LC3免疫组化染色阳性面积也未见统计学差别(P>0.05)。但是A与B、C相比较，两两之间都有统计学意义差别(P<0.05)(见图1)。
2.3皮瓣存活面积：实验组A和B 与C相比较，均有统计学意义(P<0.05)，皮瓣存活面积提高了2倍左右。但是B和C组相比较，成活面积虽然稍有提高，但是差别无统计学意义(P>0.05)(见表1)。
3 讨论
目前缺血后恢复灌注对皮瓣的危害越来越引起重视，再灌注后皮瓣损伤除了没有恢复以外，反而呈现进行性加重。但是缺血再灌注损伤的发生机制尚不完全清楚。自由基损伤常被看成缺血一再灌注损伤的主要原因之一，但抗自由基治疗的效果不理想。细胞凋亡也被认为是引起缺血再灌注损伤的一个重要原因[4]。如何预防和减轻组织缺血再灌注损伤，防止凋亡是当前医学研究的重要课题之一。
缺血后处理是通过一次或多次短暂缺血，再灌注过程而减轻组织再灌注损伤的发生的新的机械性干预措施，应用于再灌注早期。具有可预知性和可控制性的特点， 而且临床应用简单、方便、可行， 易为外科医生所接受。虽然缺血后处理已在皮瓣中应用[5-7]，但其保护机制仍然不明确。
自噬是一种存在于正常细胞和病态细胞中非选择性的降解机制， 其活化通常发生在应激状态下， 有两个主要作用：①在营养缺乏的情况下为细胞生长代谢提供必要的大分子物质和能量；②清除细胞内过剩或有缺陷的细胞器。自噬发生早于凋亡[9-10]。自噬对细胞凋亡有抑制作用11。由此笔者设想自噬激活可能是缺血后处理保护皮瓣的重要机制。
笔者的研究着重探讨缺血后处理对新西兰大白兔腹股沟皮瓣再灌注损伤的影响并且研究自噬在缺血后处理保护皮瓣机制中作用，并通过对分组处理皮瓣进行大体观察，术后7天测量皮瓣面积，研究相关的自噬指标变化。抑制细胞自噬可以抵消皮瓣的缺血后保护作用。结果证实了缺血后保护机制的激活，预防皮瓣再灌注损伤和自噬有关。但缺血后处理调节自噬的具体机制还不明确。后续的实验中将进一步探讨缺血后保护游离皮瓣激活自噬有效途径，研究自噬和细胞凋亡互相影响的机制关系。
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林煌 董勇 北京首都医科大学附属安贞医院整形激光科;
【摘要】目的:缺血后处理皮瓣在临床上已经运用,开始相关研究探究缺血后处理对皮瓣保护机制。方法:健康成年新西兰大白兔,分为3组。A组为给予缺血后处理;B组为再灌注前5mi n给予自噬阻滞剂3-甲基腺嘌呤10μl+缺血后处理。C组,直接应用微血管夹阻断腹壁浅血管持续缺。6h后再灌。各组分别进行自噬指标Becl i n1、LC3免疫组化和皮瓣存活率检测。结果:新西兰大白兔完全存活。B、C组相比较,自噬Becl i n1、LC3免疫组化染色阳性细胞面积变化未见统计学差别(P0.005)。实验组皮瓣存活面积比较,B与C相比较,无统计学意义(P0.005),但是A与B、C相比较,上述指标两两之间都有统计学意义差别(P0.005)。结论:缺血后处理对皮瓣再灌注损伤有保护作用,该作用可能和自噬激活有关。
【关键词】 皮瓣 缺血-再灌注损伤 自噬
【基金】国家自然科学基金面上项目(批准号81272130)内皮细胞A2A受体靶向介导游离皮瓣缺血后处理内源性抗凋亡机制研究的资助
【分类号】R622
近年,缺血再灌注损伤的防治逐渐成为众多学者关注的热点。自2004年zhao等学者提出了缺血后处理概念,并且通过一系列动物实验证实后处理具有心肌,肌肉等保护作用[1]。内皮细胞是皮瓣再灌注损伤的关键靶点之一。缺血后处理和血管内皮细胞保护有关[2]。最近研究发现缺血再灌注损 (林煌 董勇)
[关键词]皮瓣；缺血-再灌注损伤；自噬
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2013)02-0261-03
近年， 缺血再灌注损伤的防治逐渐成为众多学者关注的热点。自2004年zhao 等学者提出了缺血后处理概念， 并且通过一系列动物实验证实后处理具有心肌，肌肉等保护作用[1]。内皮细胞是皮瓣再灌注损伤的关键靶点之一。缺血后处理和血管内皮细胞保护有关[2]。最近研究发现缺血再灌注损伤中激活自噬有保护内皮细胞稳态的作用[3]。缺血后处理保护皮瓣作用是否和激活自噬有关，笔者将进行相关研究 以论证该假说。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立：选用健康成年新西兰大白兔24只， 雌雄不限， 体重2.5～3.5kg。以3%异戊巴比妥钠(1ml/kg)耳缘静脉注射，麻醉后以仰卧位固定，全腹部备皮后制取左侧腹股沟皮瓣约4cm×8cm，以腹壁浅血管为蒂，保留血管蒂。
1.2 实验方法与分组：24只大白兔模型建立后， 用随机数字表法平均分成3组，每组8只。对照组为C组，诱导再灌注损伤时首先微血管夹阻断腹壁浅血管缺血6h恢复正常血供；实验组持续缺血再灌注后按照前期的研究设定给予短暂缺血再灌注处理(10s缺血+10s再灌注为一个疗程，共6个疗程，持续2min)。按照自噬抑制剂使用的方式继续分为2组：A组为给予缺血后处理；B组为再灌注前5min给予腹壁浅静脉给予自噬抑制剂3一甲基腺嘌呤10μl缺血后处理。A，B组处理后实验步骤与对照组相同。在围实验期血管蒂注意保温防止痉挛。
1.3标本收集与检测：每组兔子恢复血流4h后， 取2只处死，甲醛固定皮瓣组织后HE染色下观察下观察。Abgent 公司的兔抗人微管相关蛋白轻链3(MAP1- LC3)多克隆抗体 ，Santa Cruz 公司的兔抗人自噬基因Beclin1 多克隆抗体。福建迈新生物制品公司的辣根过氧化酶标记山羊抗兔二抗体， DAB 显色。PBS 缓冲液代替一抗作为空白对照。以细胞胞浆棕黄染为阳性；显微数字图像分析系统采集、分析免疫组化结果。
其余6 只动物于术后1周判断皮瓣成活情况，计算皮瓣成活面积的百分比。
1.4 统计学方法：SPSS11.0行统计处理， 数据以均数±标准差(x±s)表示。实验组与对照组比较采用t检验，P<0.05 为有统计学意义
2 结果
2.1 大体观察：手术中和手术后1周内所有的新西兰大白兔均存活。皮瓣恢复灌注24h内， C组皮瓣远端大部分组织迅速肿胀淤紫，指压毛细血管反应消失，以后皮瓣两边逐渐发黑。术后7天坏死界限明确。A实验组皮瓣两侧边缘部分出现肿胀，色泽偏暗，指压毛细血管回流稍迟缓，一周后两侧皮瓣边缘部分失活。B，C组肉眼观察形态变化接近。
2.2皮瓣Beclin1、LC3免疫组化染色阳性细胞比较：B、C组相比较，Beclin1及LC3免疫组化染色阳性面积也未见统计学差别(P>0.05)。但是A与B、C相比较，两两之间都有统计学意义差别(P<0.05)(见图1)。
2.3皮瓣存活面积：实验组A和B 与C相比较，均有统计学意义(P<0.05)，皮瓣存活面积提高了2倍左右。但是B和C组相比较，成活面积虽然稍有提高，但是差别无统计学意义(P>0.05)(见表1)。
3 讨论
目前缺血后恢复灌注对皮瓣的危害越来越引起重视，再灌注后皮瓣损伤除了没有恢复以外，反而呈现进行性加重。但是缺血再灌注损伤的发生机制尚不完全清楚。自由基损伤常被看成缺血一再灌注损伤的主要原因之一，但抗自由基治疗的效果不理想。细胞凋亡也被认为是引起缺血再灌注损伤的一个重要原因[4]。如何预防和减轻组织缺血再灌注损伤，防止凋亡是当前医学研究的重要课题之一。
缺血后处理是通过一次或多次短暂缺血，再灌注过程而减轻组织再灌注损伤的发生的新的机械性干预措施，应用于再灌注早期。具有可预知性和可控制性的特点， 而且临床应用简单、方便、可行， 易为外科医生所接受。虽然缺血后处理已在皮瓣中应用[5-7]，但其保护机制仍然不明确。
自噬是一种存在于正常细胞和病态细胞中非选择性的降解机制， 其活化通常发生在应激状态下， 有两个主要作用：①在营养缺乏的情况下为细胞生长代谢提供必要的大分子物质和能量；②清除细胞内过剩或有缺陷的细胞器。自噬发生早于凋亡[9-10]。自噬对细胞凋亡有抑制作用11。由此笔者设想自噬激活可能是缺血后处理保护皮瓣的重要机制。
笔者的研究着重探讨缺血后处理对新西兰大白兔腹股沟皮瓣再灌注损伤的影响并且研究自噬在缺血后处理保护皮瓣机制中作用，并通过对分组处理皮瓣进行大体观察，术后7天测量皮瓣面积，研究相关的自噬指标变化。抑制细胞自噬可以抵消皮瓣的缺血后保护作用。结果证实了缺血后保护机制的激活，预防皮瓣再灌注损伤和自噬有关。但缺血后处理调节自噬的具体机制还不明确。后续的实验中将进一步探讨缺血后保护游离皮瓣激活自噬有效途径，研究自噬和细胞凋亡互相影响的机制关系。
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林煌 董勇 北京首都医科大学附属安贞医院整形激光科;
【摘要】目的:缺血后处理皮瓣在临床上已经运用,开始相关研究探究缺血后处理对皮瓣保护机制。方法:健康成年新西兰大白兔,分为3组。A组为给予缺血后处理;B组为再灌注前5mi n给予自噬阻滞剂3-甲基腺嘌呤10μl+缺血后处理。C组,直接应用微血管夹阻断腹壁浅血管持续缺。6h后再灌。各组分别进行自噬指标Becl i n1、LC3免疫组化和皮瓣存活率检测。结果:新西兰大白兔完全存活。B、C组相比较,自噬Becl i n1、LC3免疫组化染色阳性细胞面积变化未见统计学差别(P0.005)。实验组皮瓣存活面积比较,B与C相比较,无统计学意义(P0.005),但是A与B、C相比较,上述指标两两之间都有统计学意义差别(P0.005)。结论:缺血后处理对皮瓣再灌注损伤有保护作用,该作用可能和自噬激活有关。
【关键词】 皮瓣 缺血-再灌注损伤 自噬
【基金】国家自然科学基金面上项目(批准号81272130)内皮细胞A2A受体靶向介导游离皮瓣缺血后处理内源性抗凋亡机制研究的资助
【分类号】R622
近年,缺血再灌注损伤的防治逐渐成为众多学者关注的热点。自2004年zhao等学者提出了缺血后处理概念,并且通过一系列动物实验证实后处理具有心肌,肌肉等保护作用[1]。内皮细胞是皮瓣再灌注损伤的关键靶点之一。缺血后处理和血管内皮细胞保护有关[2]。最近研究发现缺血再灌注损 (林煌 董勇)