A型肉毒毒素对增生性瘢痕中TGF—31和cyclinDl基因表达影响的研究(1)
【摘要】目的：探讨A型肉毒毒素(BTXA)对增生性瘢痕组织成纤维细胞中TGF-β1和cyc linDl表达的影响。方法：组织块法培养增生性瘢痕组织及正常皮肤组织的成纤维细胞，用不同浓度的BTXA作用于体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞，检测MTT值；利用RT-PCR分析用药前后TGF-β1和cyclinDlmRNA表达的变化及其他们的相关性。结果：BTXA在体外能明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖及TGF-31和cyclinDlmRNA的表达。结论：BTXA对增生性瘢痕组织中成纤维细胞的增殖有明显抑制作用，其作用机制与BTXA能抑制TGF-31和cyclinDlmRNA的表达有关；同时在抑制成纤维细胞的过程中，TGF-β1和cyclinDlmRNA的表达并无相关性。
【关键词】A型肉毒毒素；增生性瘢痕；TGF-β1；cyclinDl
【中图分类号】R619+.6 【文献标志码】A 【文章编号】1008-6455(2015)06-0037-05
目前治疗增牛性瘢痕的方法很多，包括压迫法、放疗法、激光与手术切除法、瘢痕内药物注射法等，但迄今没有哪一种方法可以完全达到令人满意的效果。而药物注射治疗病理性瘢痕因其操作简单，费用低廉及效果明显的特点而越来越易被患者接受，其中临床常用的有曲安奈德、5-氟尿嘧啶、复方倍他米松注射液等。近来有研究用A型肉毒毒素(BTXA)治疗瘢痕取得了较好的临床治疗效果。本研究通过对A犁肉毒毒素注射治疗增牛性瘢痕的成纤维细胞中的TGF-β1和cyclinDl基因表达的影响及其相关性，研究其注射治疗增牛性瘢痕的原理，为治疗病理性瘢痕提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
标本取自本科室瘢痕患者手术切下的增生性瘢痕组织及正常的皮肤组织，患者年龄14岁～45岁，平均年龄32岁；病程4个月-2年，患者3个月内均未经过免疫治疗，放射线治疗及激光治疗，取标本前均得到患者的知情同意。
1.2 仪器与试剂
DMEM培养基(Gibco公司USA)，BTXA(兰州牛物制品研究所)，Trizol总RNA提取试剂盒，Promega逆转录试剂盒，taq酶购于日本TAKARA： MTT、DMSO购于SIGMA USA，新牛小牛血清，光学显微镜，PCR仪器。
1.3 成纤维细胞培养
将手术切下的增牛性瘢痕组织及正常的皮肤组织用含lOOU/ml青霉素和lOOμg/ml链霉素的PBS缓冲液反复冲洗三次后将其剪成Immxlmm大小的小组织块，接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液的培养方瓶中，在37.O℃，5%(体积分数)的C02、95%空气及饱和湿度的孵箱中静置培养，根据细胞的生长情况，每周更换两到三次培养液，待3周后原代细胞从组织块中长出并爬满培养瓶底后进行传代，采用0. 25%胰蛋白酶及0.02%乙二胺四乙酸消化，按1：4传代，药物实验所用细胞为4代。
1.4 MTT比色法
将第四代对数牛长期的成纤维细胞制成5xl06悬浮液，以每孔lOOμl的成纤维细胞密度接种于96孔培养板中。置于孵箱中继续孵育24h。待细胞完全贴壁后去除培养液，分别加入含浓度(U/ml)0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 BTXA的lO%小牛血清的DMEM200μ1，培养液每组设6个平行孔及空白对照孔，加药后放进孵箱中继续孵育48h。然后每孔加MTT (5mg/ml) 20μl继续孵育3h后，弃掉上清液，每孔加200μlDMSO振荡混匀，用自动酶联免疫分析仪在设定波长492nm时测定其OD值。计算药物的抑制率(IR)：IR=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%1.5 TGF-β1和cyclinDlmRNA表达的检测
将浓度为0. 4U/ml的BTXA加入含有lXl06个/ml第4代细胞的培养瓶中，放入孵箱中孵育48h，收集细胞。用TRizol试剂提取总RNA，反转录成cDNA。然后采用逆转录一聚合酶链式反应(reversetranscription polymerase chain reation，RT-PCR)进行扩增。RT-PCR反应体系为20μl，构成如下：lOxbuffer 2.5μl，dNTP 2μl，Taq酶2.5U，模板4μg，β-actin上下游引物及各特异性引物上下游各1μl，加水至总反应体积20μl。扩增条件：94C预变性5min，94。C变性30S，退火温度见下表，72。C延伸Imin，32个循环，最后72℃再延伸8min终止反应。引物设计见表1。
1.6 PCR产物分析
取8μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶扫描成像分析仪处理系统扫描各条带紫外光吸收量(Vol)。目的基因Vol值与相应内参β-actin Vol值的比值代表每个样本PCR扩增产物mRNA的相对表达量，测定并比较增牛性瘢痕与正常皮肤，以及加入肉毒毒素作用后增牛性瘢痕TGF-β1及cyclinDl基因的表达的变化。
1.7 统计学分析
采用SPPS15.0软件，用t检验法，数据以x+s表示，P (武凤莲 朱东来 王嘉欣 汤云阳 王连英)
【关键词】A型肉毒毒素；增生性瘢痕；TGF-β1；cyclinDl
【中图分类号】R619+.6 【文献标志码】A 【文章编号】1008-6455(2015)06-0037-05
目前治疗增牛性瘢痕的方法很多，包括压迫法、放疗法、激光与手术切除法、瘢痕内药物注射法等，但迄今没有哪一种方法可以完全达到令人满意的效果。而药物注射治疗病理性瘢痕因其操作简单，费用低廉及效果明显的特点而越来越易被患者接受，其中临床常用的有曲安奈德、5-氟尿嘧啶、复方倍他米松注射液等。近来有研究用A型肉毒毒素(BTXA)治疗瘢痕取得了较好的临床治疗效果。本研究通过对A犁肉毒毒素注射治疗增牛性瘢痕的成纤维细胞中的TGF-β1和cyclinDl基因表达的影响及其相关性，研究其注射治疗增牛性瘢痕的原理，为治疗病理性瘢痕提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
标本取自本科室瘢痕患者手术切下的增生性瘢痕组织及正常的皮肤组织，患者年龄14岁～45岁，平均年龄32岁；病程4个月-2年，患者3个月内均未经过免疫治疗，放射线治疗及激光治疗，取标本前均得到患者的知情同意。
1.2 仪器与试剂
DMEM培养基(Gibco公司USA)，BTXA(兰州牛物制品研究所)，Trizol总RNA提取试剂盒，Promega逆转录试剂盒，taq酶购于日本TAKARA： MTT、DMSO购于SIGMA USA，新牛小牛血清，光学显微镜，PCR仪器。
1.3 成纤维细胞培养
将手术切下的增牛性瘢痕组织及正常的皮肤组织用含lOOU/ml青霉素和lOOμg/ml链霉素的PBS缓冲液反复冲洗三次后将其剪成Immxlmm大小的小组织块，接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液的培养方瓶中，在37.O℃，5%(体积分数)的C02、95%空气及饱和湿度的孵箱中静置培养，根据细胞的生长情况，每周更换两到三次培养液，待3周后原代细胞从组织块中长出并爬满培养瓶底后进行传代，采用0. 25%胰蛋白酶及0.02%乙二胺四乙酸消化，按1：4传代，药物实验所用细胞为4代。
1.4 MTT比色法
将第四代对数牛长期的成纤维细胞制成5xl06悬浮液，以每孔lOOμl的成纤维细胞密度接种于96孔培养板中。置于孵箱中继续孵育24h。待细胞完全贴壁后去除培养液，分别加入含浓度(U/ml)0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 BTXA的lO%小牛血清的DMEM200μ1，培养液每组设6个平行孔及空白对照孔，加药后放进孵箱中继续孵育48h。然后每孔加MTT (5mg/ml) 20μl继续孵育3h后，弃掉上清液，每孔加200μlDMSO振荡混匀，用自动酶联免疫分析仪在设定波长492nm时测定其OD值。计算药物的抑制率(IR)：IR=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%1.5 TGF-β1和cyclinDlmRNA表达的检测
将浓度为0. 4U/ml的BTXA加入含有lXl06个/ml第4代细胞的培养瓶中，放入孵箱中孵育48h，收集细胞。用TRizol试剂提取总RNA，反转录成cDNA。然后采用逆转录一聚合酶链式反应(reversetranscription polymerase chain reation，RT-PCR)进行扩增。RT-PCR反应体系为20μl，构成如下：lOxbuffer 2.5μl，dNTP 2μl，Taq酶2.5U，模板4μg，β-actin上下游引物及各特异性引物上下游各1μl，加水至总反应体积20μl。扩增条件：94C预变性5min，94。C变性30S，退火温度见下表，72。C延伸Imin，32个循环，最后72℃再延伸8min终止反应。引物设计见表1。
1.6 PCR产物分析
取8μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶扫描成像分析仪处理系统扫描各条带紫外光吸收量(Vol)。目的基因Vol值与相应内参β-actin Vol值的比值代表每个样本PCR扩增产物mRNA的相对表达量，测定并比较增牛性瘢痕与正常皮肤，以及加入肉毒毒素作用后增牛性瘢痕TGF-β1及cyclinDl基因的表达的变化。
1.7 统计学分析
采用SPPS15.0软件，用t检验法，数据以x+s表示，P (武凤莲 朱东来 王嘉欣 汤云阳 王连英)