三种方法冻存间充质干细胞存活率的比较
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【中图分类号】R394.2【文献标识码】B【文章编号】1008-6455(2011)04-0373-02
近年来，掀起干细胞研究和应用的热潮，尤其是MSC已经广泛应用于临床各种疾病的治疗。因而，MSC的冷冻保存及其复苏后的存活对干细胞的临床应用尤为重要。本文对三种冻存方法进行了对比，以寻求MSC较佳的冻存方法。
1 材料与试剂
1.1 材料： 健康供者胎儿脐带，肝炎病毒标志物、梅毒、HIV检测均阴性。经医院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂与仪器:α-MEM培养基(Hyclone 公司)胰蛋白酶(GIBCO公司) 优等胎牛血清 (FBS) Hyclone，细胞培养瓶(美国corning) 二氧化碳培养箱(美国Thermo 371型)倒置显微镜(日本Olympus)程序降温盒(美国 Nalgene)DMSO(sigma), 冻存管(corning)。
2 方法
2.1 脐带源MSC的分离培养:采用本实验建立的脐带源间充质干细胞分离培养方法[1]。无菌取足月剖宫产健康胎儿脐带,采集后6h内处理。用加双抗的PBS洗涤至无血迹变白，去除血管后剪成小片并进一步剪碎成泥状后转入50ml离心管中，加PBS，1200rpm，10min，洗涤3遍。洗涤完毕将沉淀用少量培养基浸润混匀后，种到培养皿中于5% CO2培养箱内培养。48h首次换液，以后每隔2-3天换液，待细胞长满皿底，此时用PBS 冲掉组织块，胰酶消化贴壁细胞，进行传代，种到培养瓶内于5% CO2培养箱继续培养并传代。倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长情况， 并适时照相。
2.2 冻存实验:收集生长良好的P5代细胞[2](文献资料表明，临床试验用干细胞为P5左右)，取少量细胞悬浮液(约 0.1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率，其余细胞加入预先配置好预冷的冻存液中(含有 10% 二甲基亚砜(DMSO)和 30% 胎牛血清的新鲜α-MEM培养基)， 分装入1.5ml 无菌塑料冷冻保存管, 以每冻存管5×106 个细胞为单位，冻存分三组。每组21管：
组1 4℃ 10分钟 -20℃ 30分钟-80 ℃24小时后转液氮。
组2 4℃ 30分钟 -20℃ 1小时 -80 ℃24小时后转液氮。
组3 Nalgene程序降温盒冷冻法 将程序降温盒预先4℃ 预冷6小时以上，将冻存管放入盒中立即放入-80 ℃ 低温冰箱， 24小时后转液氮。
2.3 复苏细胞:分别于冻存3个月每组复苏7管，6个月每组复苏7管，12个月每组复苏7管，38℃水浴，1-2分钟内快速溶解细胞后用PBS洗涤两遍，用台盼蓝染色计数细胞复苏存活率并种到培养瓶中继续培养。
3 结果
3.1 脐带组织细胞贴壁生长，第10d已有较多细胞爬出并倍增，第13d可爬满皿底，呈旋涡状，放射状均匀生长(见图1)。传代细胞3-5天长满。
3.2 冻存后复苏存活率：从下图中数据可看出组3细胞存活率明显高于其他两组。组内不同月份复苏细胞存活率无明显差别。见表1
3.3 复苏后细胞接种培养瓶后，组1，组2平均四天长满，组3平均三天长满，形态与冻存前无明显差异。
表1
4 讨论
利用干细胞的再生和分泌多种细胞因子的能力治疗各种疾病已经被广泛应用，而且要求干细胞移植数量也逐渐增加。从原代提取到培养出够一定移植数量的干细胞需一个月的时间，所以需要简便，稳定的方法冻存干细胞以便随时复苏足够量的干细胞供移植应用[3]。细胞储存在-80℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存的关键是如何通过冰点而不受损伤，所以我们加入了冷冻保护剂DMSO，可使溶液冰点降低，细胞内水分透出，减少了冰晶形成。另外，冻存后细胞存活率还跟降温速度有很大关系[4]。本实验数据表明，传统的冻存方法-4℃10分钟，-20℃30分钟或4℃30分钟 ，-20℃1小时再-80℃冻存细胞存活率在80%以下，而利用美国Nalgene程序降温盒冻存脐带源间充质干细胞后再转入液氮，复苏存活率在90%以上，明显高于传统方法。程控降温仪冻存细胞是国际上公认的高存活率的稳定的方法，但仪器本身价格昂贵，操作技术要求高，不能普及应用。程序降温盒夹层内装有异丙醇，降温速率1 ℃/min，由于细胞存活率高，复苏后接种培养能快速长满，操作简便。本实验室自2009年末至今一直采用此种方法冻存间充质干细胞 ......
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