高效液相色谱－电喷雾串联四极杆质谱法研究大鼠尿内毛果芸香碱代谢产物
 |
摘要：首次应用高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法鉴定了大鼠灌胃给予毛果芸香碱0.2mg后0-8小时内尿中的代谢物。4只大鼠给药毛果芸香碱盐酸盐，收集给药后尿液，固相萃取柱富集、然后应用高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法在线进行多反应监测，进而对尿中微量的代谢物进行了质谱解析。分别定性为毛果芸香碱的葡萄糖醛酸结合物、毛果芸香酸和毛果芸香酸的葡萄糖醛酸结合物。而且发现了各种代谢产物及原形药物在大鼠体内均有构型变化。
关键词：毛果芸香碱；代谢物；液相色谱-串联质谱法
Study on metabolites of pilocarpine in rat urine using high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry
AbstractMetabolism of pilocarpine in rat urine was studied by high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometric method after single oral dose 0.1 mg. The urine sample was prepared by solid phase extraction, and then was analyzed using multiple reaction monitoring. Five metabolites were identified as oxidative metabolite pilocarpic acid and the glucuronides of pilocarpine and pilocarpic acid.
, http://www.100md.com
[Keywords] pilocarpine; metabolite; liquid chromatography-tandem mass spectrometry
毛果芸香碱(pilocarpine，中文译名匹罗卡品)滴眼液是临床上应用较久、疗效确定的抗青光眼常用药物[1]。近年来发现口服毛果芸香碱，能促进唾液分泌，可作为抗口腔干燥症药。对于毛果芸香碱的研究报道主要集中在药理活性，药物动力学等方面[2,3]。对于毛果芸香碱在大鼠体内的代谢转化情况尚未见报道。液相色谱质谱联用技术在是目前药物代谢研究领域的首选工具[4，5]。本文采用高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法对大鼠灌胃给予毛果芸香碱后的尿样的代谢产物鉴定。
1 实验部分
1.1 仪器与材料
毛果芸香碱和毛果芸香酸购自Sigma公司，纯度>99%；甲醇、乙腈为天津康科德公司生产；水为二次重蒸水；
, 百拇医药
美国ABI公司 API4000型串联四极杆质谱仪，配有电喷雾电离源(ESI)及Analyst1.4 数据处理系统；美国Agilent公司Agilent1100高效液相色谱系统
1.2 实验方法
1.2.1 样品制备 4只Wistar大鼠(200~250g)禁食12h，收集空白尿样；然后给予毛果芸香碱盐酸盐0.1mg。收集给药后8小时以内的尿样并加入EDTA置于-20OC冰箱中保存待测。尿样经滤纸和0.45um微孔滤膜过滤用甲醇、水各1ml依次活化Bond Elute C18固相萃取小柱(美国Agilent公司)，上样1ml，用水1ml洗涤，再用甲醇1ml洗脱，取20ul进样。
1.2.2 LC/MS分析条件 色谱柱为 Diamond C18 柱 (300×4.6mm 粒径，5u迪马公司)；流动相为1%甲酸：甲醇(95：5；v/v)流速为1 ml/min，分流比1：1，柱温 25OC；进样量为20ul。质谱采用正离子模式检测；离子源喷射电压4500V；DP电压78 V；碰撞能量40 eV；源内气体1为50 p.s.i. 源内气体2为40 p.s.i.；温度500OC； 碰撞气3 p.s.i.；监测方式，多反应监测(MRM)，用于监测的离子对为m/z 209→96(毛果芸香碱)、227→96(毛果芸香酸)、385→209(毛果芸香碱葡萄糖醛酸结合物)、403→227(毛果芸香酸的葡萄糖醛酸结合物)。
, 百拇医药
2结果与讨论
通过空白尿样与给药后尿样的MRM质量色谱图对照可见，给药后尿样MRM质量色谱图(图1)中有6个新增的色谱峰，保留时间分别为9.78、10.69、12.52、6.57、7.16和8.97 min；分别定义为M0、 M1、 M2、 M3、M4和M5。其中M0，准分子离子为 m/z 209 的化合物，与毛果芸香碱对照品的色谱和各级质谱行为相同，为原形药物。M1的准分子离子也为m/z 209 与原形药物比较分子量相同，且二级质谱图也完全相同，初步推测为原形药异构化产物。M2的的准分子离子为m/z 227，比原形药多18个质量单位。推测为内酯环水解开环形成毛果芸香酸，与标准品对照，色谱行为，质谱行为一致，鉴定为毛果芸香酸。M3和M4的准分子离子均为m/z 385比原形药多176个质量单位，推测为原形药物的葡萄糖醛酸结合物，一般药物及其代谢物分子中含有-OH、-COOH、-NHR、-SH等基团时，其自体内消除的主要途径是与内源性的β-葡糖醛酸发生结合[4]。所以葡萄糖醛酸可能与咪唑基的氮原子结合形成季铵盐形式。另外原形药物能发生构型的转变，所以其葡萄糖醛酸应当也有两种形式。由于含量极低，只有原形药物的千分之一。因此只能从质谱上推断为原形药物的葡萄糖醛酸结合物。同理推测M5毛果芸香酸的葡萄糖醛酸结合物。
, 百拇医药
本文利用高效液相色谱-电喷雾串联四极杆质谱法首次考察了毛果芸香碱在大鼠尿中的代谢情况。毛果芸香碱在大鼠体内主要经历3种代谢途径：葡萄糖醛酸化、内酯环水解形成毛果芸香酸及形成毛果芸香酸的葡萄糖醛酸结合物，见图2。
参考文献
1 Ferguson M. M., Oral. Surg. Oral. Med. Oral. Pathol. [J], 1993, 75: 186-190
2 Lin H. R., Sung K. C., Vong W. J., Biomacromolecules [J], 2004, 5 (6): 2358-2365
3 Aromdee C., Fawcett J. P., Ledger R., J. Chromatogr. B [J], 1996, 688: 313-318
4 CHU Da-Feng (初大丰)，GU Jing-Kai (顾景凯)，ZHONG Da-Fang (钟大放)，SI Duan-Yun(司端运)et al., Chem. J. Chinese Univesities (高等学校化学学报) [J]，2002, 23 (3): 376-678
5 GU Jing-Kai (顾景凯)，CHU Da-Feng (初大丰)，ZHONG Da-Fang (钟大放)，LI Yan(李艳)et al., Chem. J. Chinese Univesities (高等学校化学学报) [J]，2002, 23 (2): 207-209, 百拇医药(张 喆 齐 影)