复方土牛膝糖浆剂抗病毒作用的实验研究(1)
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钟希文 崔小兰 田素英 高玉桥 吴惠妃 林 慧 高英杰 金亚弘 张 毅 李德凤
摘 要：目的：观察复方土牛膝糖浆剂在体外和动物模型上的抗病毒作用。方法：用细胞培养法，通过观察细胞病变评价复方土牛膝糖浆剂对常见的致上呼吸道感染的柯萨奇B族病毒4型(CoxB4)、副流感病毒(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒(HSV-I)所致的细胞病变(CPE)的抑制作用；通过用流感病毒滴鼻感染小鼠来研究复方土牛膝糖浆剂对病毒感染小鼠所引起的死亡保护作用。结果：复方土牛滕糖浆在体外对CoxB4、RSV病毒的致细胞病变作用有明豆抑制作用，其IC50分别为2.0、2.8μL糖浆/mL，TI分别为5.6和4，对HSV-1、副流感-1型病毒的致细胞病变有一定的抑制作用。其IC50分别为4.0、5.0μL工糖浆/mL，TI分别为2.8和2.24。在小鼠感染病毒15天内，复方土牛膝糖浆5mL/(kg·d)剂量组动物的死亡率为55%；死亡保护率分别为38.39%，与感染对照组相比有显著差异(P<0.05)，复方土牛膝糖浆10mL/(kg·d)、5mL/(kg·d)两个剂量组小鼠的存活天数较感染组明显延长。与对照组比较有显著性差异。生命延长率分别为17.67%和22.22%。结论：复方土牛膝糖浆剂无论在体内或是体外均有较明显的抗病毒作用。
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关键词：复方土牛膝糖浆剂；抗病毒；细胞病变；小鼠死亡保护
复方土牛膝糖浆剂是中山市中医院的自制制剂，临床上用于治疗急慢性咽喉炎、扁桃体炎等上呼吸道感染病症疗效显著。为该复方在临床上的应用提供科学依据，笔者对复方土牛膝糖浆剂的抗病毒作用进行了研究，现把研究情况报道如下。
1 材料与试剂
1.1 药品复方土牛膝糖浆剂(0.92g/mL，取广东土牛膝、岗梅根、山芝麻等煎煮2次，第1次煎煮2h，第2次煎煮1.5h，合并两次滤液，浓缩至密度为0.92g/mL，即可。)中山中医院制剂室提供，批号：060213；实验时糖浆稀释为1:128-1:10244个稀释度用于实验。病毒唑，湖北滨湖制药厂生产，批号：970512，体外时用量为180μg/mL；体内时小鼠按临床等效剂量0.07g/(kg·d)灌胃给药。
1.2 病毒柯萨奇B族病毒4型(CoxB4)、副流感病毒(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒(HSV-I)、分别购自中国预防医学科学院病毒研究所及儿科研究所，本实验室传代后使用。流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FMl)，购自中国预防医学科学院病毒研究所，由本研究室传代，-70℃保存备用。
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1.3 细胞人喉癌传代细胞Hep-2株，购自中国预防医学科学院病毒研究所，本实验室传代后使用。
1.4 细胞培养液含10%小牛血清、0.29mg谷氨酰胺/mL、100U/mL青、链霉素的Eagles MEM(日本日水制药株式会社出品)；细胞维持液，除所含小牛血清为2%外，其他含量均同培养液。
1.5 主要仪器CO2培养箱，日本Yamato松株式会社产品。倒置显维镜，日本Olympus产品。
1.6 动物ICR小鼠，雌雄兼用。体重为(14±1)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2002-0003。
1.7 统计学处理实验结果用(x±s)表示，数据采用SPSSVl0.0软件包进行分析，用t检验。
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2 实验方法
2.1 复方土牛膝糖浆的体外抗病毒实验①药物对Hep-2培养细胞的毒性试验：实验前将复方土牛膝糖浆用Eagle§培养液作1:2-1:512倍比稀释后，加到已长成单层的Hep-2细胞培养板中，100μL孔，每个稀释度药液做4个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃ CO2培养箱中培养4天，置显微镜下观察细胞生长情况，确定细胞不出现明显退变的最低稀释倍数(最大浓度)，实验时顺延做到最小有效浓度(即最大稀释倍数)。按Reed-Muench法计算50%毒性浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
②对病毒致细胞病变作用的影响：取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，接种100TCID50的不同病毒液50μL，置37℃ 5%C02培养箱中吸附1h后，倒掉病毒液，用不含小牛血清的Eagles维持液洗细胞面2次后，加入相应稀释度的药液100μL孔。同时设病毒对照、阳性对照药及正常细胞对照。置37℃5%CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变，当病毒对照组细胞病变为++++时记录实验结果。细胞病变按6级标准判断，并按Reed-Muench计算50%有效浓度(IC50)和治疗指数(IT):-:细胞生长正常，无病变出现；±：细胞病变少于整个单层的10%；1：细胞病变约占整个单层细胞的25%以下；2：细胞病变约占整个单层细胞的50%以下；3：细胞病变约占整个单层细胞的75%以下；4：细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。治疗指数(IT)=TC50/IC50。
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2.2 复方土牛膝糖浆对流感病毒致小鼠死亡的保护作用①剂量设计：人临床用量为60mL/60(kg·d)，小鼠体内实验分别采用20、10、5mL/(kg·d)3个剂量组(分别相当与人临床用量的2倍、等倍和1/2倍)。②病毒引起小鼠死亡最小毒力的测定：将病毒用生理盐水稀释成0.5-4LD50的不同病毒液，取小鼠50只，每个稀释度10只，0.05mL/只滴鼻感染。观察动物的死亡情况，取感染后15天内动物死亡率在90%以上的浓度，为实验时的感染量。实验结果显示：2LD50感染时，小鼠的死亡率为90%，故将其定为实验时的感染量。③观察对动物死亡保护情况：取小鼠100只，按体重随机分成5组。分别为复方土牛膝糖浆3个剂量组、病毒唑阳性对照组及病毒感染对照组。各给药组灌胃给药，每天1次，每次0.2mL/10g体重，连续7天，病毒对照组在同等条件下给予蒸馏水。给药第2天各组小鼠用乙醚轻度麻醉后，以2个ID50流感病毒液滴鼻感染，每只
0.05mL0记录感染后小鼠的死亡数，计算死亡率、死亡保护率及平均存活天数、生命延长率。计算公式分别为：死亡率%=死亡动物数/动物总数×100%；死亡保护率%=(对照组死亡率一实验组死亡率)/对照组死亡率
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