针刺对实验性快速性心律失常大鼠延髓Gi-mRNA表达的影响(1)
摘要：目的：探讨针刺内关穴调节快速性心律失常的效应机理。方法：电针乌头碱所致的快速性心律失常模型大鼠双侧“内关”穴，观察针刺前后心律(率)变化；用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定延髓中抑制性G蛋白(Gi)mRNA的相对含量。结果：针刺治疗组与模型组相比有显著变化(P<0.05)。结论：快速性心律失常可能和延髓中G蛋白基因表达障碍有关；G蛋白在针刺内关穴对心律失常的调节中有重要作用。
关键词：针刺；内关；心律失常；延髓；抑制性C蛋白；RT-PCR
中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)09-1828-03
心律失常是临床常见病证，发病机制复杂。临床和实验资料表明针刺“内关”穴对其疗效确切。G蛋白是生物信息转导过程关键的中介体，可以耦联多种受体和效应器，引起一系列细胞“瀑布”效应。笔者在以往实验中发现，针刺“内关”穴对快速性及缓慢性心律失常大鼠心肌组织中c蛋白基因表达均有调节作用。本实验通过对针刺“内关”穴调节心血管神经中枢一延髓的Gi(Gi2、Gi3)-mRNA表达的观察，探讨快速性心律失常可能和延髓中G蛋白基因表达障碍有关，为临床针灸治疗心律失常提供理论依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 健康成年Wistar大鼠40只，由沈阳药科大学实验动物中心提供(Ⅰ级，批号：0001315)，体重(200±50)g。在本校实验动物中心饲养1周，以适应环境。
随机分为4组，每组10只。即正常组(A)；乌头碱造模组(B)(乌头碱造模不针刺)；乌头碱“内关”穴组(C)(乌头碱造模加针刺“内关”穴)；乌头碱“非经非穴”组(D)(乌头碱造模加针刺“非经非穴”)。
1.2 试剂与仪器 乌头碱(批号：110720-200410，购于中国药品生物制品检定所)。组织总RNA试剂盒、RT-PCR试剂盒、Gi2-mRNA和Gi3-mRNA引物、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物(均由大连宝生物工程有限公司合成提供)；蛋白核酸分析仪(DU-600)；PCR仪(PE9600)；电泳仪(EPS-300)；凝胶成像分析系统(GIS120D)；电针仪(6805-A)等。
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1.3 动物模型的制备 20%氨基甲酸乙酯(5mL/kg)腹腔注射麻醉，于舌下静脉注射0.002%的乌头碱(1mL/kg)。以心电图出现室性早搏二联律、室性心动过速等心律失常波形为造模成功标志。
1.4 电针方法及取材 根据《实验针灸学》大鼠针灸穴位取“内关”穴，非经非穴点取大鼠肩三角肌隆起处。用0.5寸毫针(中0.25mm)直刺2-3mm，加电针(疏密波，频率2-20Hz，强度2-3mA；或以大鼠前肢微颤为宜)，行针10min，记录心电图，然后立即从腹主动脉抽血3-5mL(减少体循环血量，防止脑组织中血液过多影响实验结果)，迅速开颅，依据《实验动物解剖图谱》取出延髓，置于0℃冰盐水中，剪取含延髓腹外侧区(VLM)(参考猫VLM范围：从延髓外侧网状核尾端向头端延伸至上橄榄核水平；其背侧分界在尾端为延髓中央腹侧亚核的腹面，头端为巨细胞核、小细胞核及三叉脊束核头部的腹面，腹侧缘为延髓的腹侧表面；内、外侧分界分别为中缝核群的外侧和脊髓小脑束的内侧)在内的50mg标本放入经DEPC(焦碳酸二乙酯)水处理过的EP管中，-70℃冷冻备用。取材时间均在尚未恢复正常心律时。
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1.5 心率测定方法 大鼠麻醉后，仰卧固定于自制鼠台上，用MS2000多媒体化生物信号记录分析系统，按人体标准导联的方法连接，将针状电极插入四肢末端及剑突皮下，分别记录A组、B组给药后和C、D两组针刺后心电图，取连续10个心电周期计算平均值做为实验大鼠的心率。
1.6 逆转录-聚合酶链反应组织总RNA提取：取组织标本，按试剂盒说明书用Trizol提取总RNA，用蛋白核酸分析仪分析其纯度OD260/280，各样本均在1.9-2.0之间。逆转录：取lugRNA按逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成eDNA，经30次循环后将产物保存在-70℃冰箱中备用。PCR扩增反应：PCR反应体系：逆转录产物20μL，上下游引物各1μL，MgSO 46μL，5×Buffer 16μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，dH2O 55.5μL，总反应体系100μL。按照以下步骤进行扩增：94℃30s，56℃30s，72℃1min，循环35次，最后72℃延伸5min。选择GAPDH(528bp)作为内参与上述反应体系相同。产物分析：取12.5μLPCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳1h，EB染色，紫外透射仪观察，应用凝胶图象处理系统扫描摄像各条带的光密度，以GAPDH产物的光密度值作为内参，计算不同条件下Gi2(Gi3)-mRNA/GAPDH扩增量的比值进行半定量分析。此比值为Gi2-mRNA、Gi3-mRNA的相对表达量。
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1.7 统计学方法 实验数据用均值±标准差(以x±s)表示，用SPSS10.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析F检验。
2 结 果
2.1 Gi2Gi3的序列测定结果 所测得的Gi2Gi3PCR产物核苷酸序列与文献报道完全一致。
2.2 对快速性心律失常模型大鼠的观察 经舌下静脉注射乌头碱后数秒至4min内出现室性早搏、室性心动过速等快速性心律失常波形，持续时间90min左右。与文献报道一致。
2.3 针刺对快速性心律失常大鼠心率(律)及延髓Gi-mRNA表达的影响结果。心率变化：B组心率比A组明显加快，有显著差异(P<0.05)，C组比B组减慢，有显著差异(P<0.05)，而D组与B组相比元显著差异(P>0.05)。心律变化：经舌下静脉注射乌头碱，出现快速性心律失常波形后，给予电针针刺双侧“内关”穴，10min后转律，基本恢复为正常窦性心律。电针非经非穴10min后心律无明显变化。Gi-mRNA表达的变化：B组与A组比，延髓Gi2、Gi3-mRNA表达明显下降(P<0.05)；C组(针刺“内关”穴后)Gi2、Gi3-mRNA表达上升，与B组比差异显著(P<0.05)，而D组与B组相比元显著差异(P>0.05)。
注：与A组比较，P<0.05；#与B组比较，P<0.05；#与D组, 百拇医药(郑利岩 陈 颖 曹 震 张小卿 岳志军)
关键词：针刺；内关；心律失常；延髓；抑制性C蛋白；RT-PCR
中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)09-1828-03
心律失常是临床常见病证，发病机制复杂。临床和实验资料表明针刺“内关”穴对其疗效确切。G蛋白是生物信息转导过程关键的中介体，可以耦联多种受体和效应器，引起一系列细胞“瀑布”效应。笔者在以往实验中发现，针刺“内关”穴对快速性及缓慢性心律失常大鼠心肌组织中c蛋白基因表达均有调节作用。本实验通过对针刺“内关”穴调节心血管神经中枢一延髓的Gi(Gi2、Gi3)-mRNA表达的观察，探讨快速性心律失常可能和延髓中G蛋白基因表达障碍有关，为临床针灸治疗心律失常提供理论依据。
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1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 健康成年Wistar大鼠40只，由沈阳药科大学实验动物中心提供(Ⅰ级，批号：0001315)，体重(200±50)g。在本校实验动物中心饲养1周，以适应环境。
随机分为4组，每组10只。即正常组(A)；乌头碱造模组(B)(乌头碱造模不针刺)；乌头碱“内关”穴组(C)(乌头碱造模加针刺“内关”穴)；乌头碱“非经非穴”组(D)(乌头碱造模加针刺“非经非穴”)。
1.2 试剂与仪器 乌头碱(批号：110720-200410，购于中国药品生物制品检定所)。组织总RNA试剂盒、RT-PCR试剂盒、Gi2-mRNA和Gi3-mRNA引物、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物(均由大连宝生物工程有限公司合成提供)；蛋白核酸分析仪(DU-600)；PCR仪(PE9600)；电泳仪(EPS-300)；凝胶成像分析系统(GIS120D)；电针仪(6805-A)等。
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1.3 动物模型的制备 20%氨基甲酸乙酯(5mL/kg)腹腔注射麻醉，于舌下静脉注射0.002%的乌头碱(1mL/kg)。以心电图出现室性早搏二联律、室性心动过速等心律失常波形为造模成功标志。
1.4 电针方法及取材 根据《实验针灸学》大鼠针灸穴位取“内关”穴，非经非穴点取大鼠肩三角肌隆起处。用0.5寸毫针(中0.25mm)直刺2-3mm，加电针(疏密波，频率2-20Hz，强度2-3mA；或以大鼠前肢微颤为宜)，行针10min，记录心电图，然后立即从腹主动脉抽血3-5mL(减少体循环血量，防止脑组织中血液过多影响实验结果)，迅速开颅，依据《实验动物解剖图谱》取出延髓，置于0℃冰盐水中，剪取含延髓腹外侧区(VLM)(参考猫VLM范围：从延髓外侧网状核尾端向头端延伸至上橄榄核水平；其背侧分界在尾端为延髓中央腹侧亚核的腹面，头端为巨细胞核、小细胞核及三叉脊束核头部的腹面，腹侧缘为延髓的腹侧表面；内、外侧分界分别为中缝核群的外侧和脊髓小脑束的内侧)在内的50mg标本放入经DEPC(焦碳酸二乙酯)水处理过的EP管中，-70℃冷冻备用。取材时间均在尚未恢复正常心律时。
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1.5 心率测定方法 大鼠麻醉后，仰卧固定于自制鼠台上，用MS2000多媒体化生物信号记录分析系统，按人体标准导联的方法连接，将针状电极插入四肢末端及剑突皮下，分别记录A组、B组给药后和C、D两组针刺后心电图，取连续10个心电周期计算平均值做为实验大鼠的心率。
1.6 逆转录-聚合酶链反应组织总RNA提取：取组织标本，按试剂盒说明书用Trizol提取总RNA，用蛋白核酸分析仪分析其纯度OD260/280，各样本均在1.9-2.0之间。逆转录：取lugRNA按逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成eDNA，经30次循环后将产物保存在-70℃冰箱中备用。PCR扩增反应：PCR反应体系：逆转录产物20μL，上下游引物各1μL，MgSO 46μL，5×Buffer 16μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，dH2O 55.5μL，总反应体系100μL。按照以下步骤进行扩增：94℃30s，56℃30s，72℃1min，循环35次，最后72℃延伸5min。选择GAPDH(528bp)作为内参与上述反应体系相同。产物分析：取12.5μLPCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳1h，EB染色，紫外透射仪观察，应用凝胶图象处理系统扫描摄像各条带的光密度，以GAPDH产物的光密度值作为内参，计算不同条件下Gi2(Gi3)-mRNA/GAPDH扩增量的比值进行半定量分析。此比值为Gi2-mRNA、Gi3-mRNA的相对表达量。
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1.7 统计学方法 实验数据用均值±标准差(以x±s)表示，用SPSS10.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析F检验。
2 结 果
2.1 Gi2Gi3的序列测定结果 所测得的Gi2Gi3PCR产物核苷酸序列与文献报道完全一致。
2.2 对快速性心律失常模型大鼠的观察 经舌下静脉注射乌头碱后数秒至4min内出现室性早搏、室性心动过速等快速性心律失常波形，持续时间90min左右。与文献报道一致。
2.3 针刺对快速性心律失常大鼠心率(律)及延髓Gi-mRNA表达的影响结果。心率变化：B组心率比A组明显加快，有显著差异(P<0.05)，C组比B组减慢，有显著差异(P<0.05)，而D组与B组相比元显著差异(P>0.05)。心律变化：经舌下静脉注射乌头碱，出现快速性心律失常波形后，给予电针针刺双侧“内关”穴，10min后转律，基本恢复为正常窦性心律。电针非经非穴10min后心律无明显变化。Gi-mRNA表达的变化：B组与A组比，延髓Gi2、Gi3-mRNA表达明显下降(P<0.05)；C组(针刺“内关”穴后)Gi2、Gi3-mRNA表达上升，与B组比差异显著(P<0.05)，而D组与B组相比元显著差异(P>0.05)。
注：与A组比较，P<0.05；#与B组比较，P<0.05；#与D组, 百拇医药(郑利岩 陈 颖 曹 震 张小卿 岳志军)