葛根素注射液对K562/Adr细胞化疗药物敏感性及机理研究(1)
摘要：目的：通过观察葛根素注射液协同化疗药物对K562/Adr白血病耐药细胞的抑制作用，探讨葛根素增加白血病耐药细胞对化疗药物的敏感性及作用机理。方法：选K562/Adr耐药细胞株作为靶细胞，采用MTF法观察不同浓度的葛根素注射液对K562/Adr耐药细胞增殖的影响，及细胞对化疗药物的敏感性。RT-PCR的方法检测葛根素对耐药相关基因(MDR1/P-gp、MRP)表达的影响。结果：MTT法结果显示低到中等浓度的葛根素(25-100μg/mL)对H562/Adr耐药株的生长与对照组相比无显著差异(P>0.05)，但当葛根素浓度提高至250μg/mL以上时，对细胞则出现增殖抑制作用，且随浓度增加抑制作用增强。用不同浓度的葛根素和化疗药物(Adr 1μg/mL)合用时结果显示，低浓度(25-50μg/mL)的实验组与对照组无显著差异(P>0.05)；随着葛根素浓度增加(100-500μg/mL)，Adr对细胞的抑制作用明显，即K562/Adr对Adr的敏感性与葛根素呈剂量依赖美系。K562/Adr细胞经葛根素(100μg/mL)处理1周后，MDR1基因表达受到抑制，是未经处理细胞的2.5倍，MRP基因表达在处理前后无明显变化；当处理1个月后，细胞中MDR1、MRP两基因表达均明显低于未经处理过的细胞，分别是未经处理细胞的2.6倍和3.5倍。结论：葛根素注射液在一定浓度下，能直接抑制白血病耐药细胞增殖，并能提高耐药细胞对化疗药物的敏感性；其机制可能通过对耐药相关基因(MDR 1、MRP)表达抑制来起作用。
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关键词：葛根素注射液；MDR1；MRP；K562/Adr细胞株
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)09-1926-03
白血病化疗失败和复发的原因之一就是白血病细胞的耐药性。目前发现白血病细胞的多药耐药(MDR)的产生机制是多因素的，且有不同的耐药表型。因此对于MDR产生的机理及如何克服耐药性问题一直是国内外专家的研究热点。葛根素主要从豆科植物野葛的干燥根中提取、分离而得。具有扩张血管、降血脂血压、改善微循环、抗氧化、抗血栓形成，修复内皮细胞损伤及抑制脑细胞凋亡等药理作用。然而对多药耐药方面研究尚少。本文观察了慢性粒细胞白血病急变细胞株的耐药株K562/Adr在葛根素干预前后对化疗药物的敏感性及作用机制，为揭示白血病细胞耐药机制，寻找有效的逆转耐药药物提供实验依据。
1 材 料
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1.1 细胞系
K562/Adr(耐药株)由中国医学科学院天津血液病研究所提供。K562/Adr为阿霉素(Adr)长期诱导K562敏感株而建立的耐药细胞株。
1.2 试 剂
阿霉素(Adramyein，Adr)为意大利法玛西亚普强公司产品。葛根素注射液购自浙江康恩贝制药股份有限公司，每支5mL(5mL：0.25g)。Tfizol购自lnvitmgen公司。
2 实验方法
2.1 细胞系的培养
耐药株K562/Adr在含2μg/mL阿霉素(Adr)的10%小牛血清RPMI 1640培养液中培养传代，实验前14天K562/Adr在元Adr的1640培养液中培养，取对数生长期的细胞进行实验。
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2.2 MTT法检测细胞增殖和药敏试验
取停药2周后的对数生长期细胞作MTT试验：增殖抑制试验(不同浓度的葛根素对细胞的作用)，每孔 200μL培养体系含10%小牛血清、5×104细胞/mL和不同浓度的葛根素(终浓度分别为：25、50、100、250和500μg/mL)每个浓度作4个平行孔，以不加葛根素的作对照组。化疗药物敏感性试验(葛根素与化疗药物Adr的协同作用)，培养体系含小牛血清、细胞和不同浓度的葛根素均与上述增殖抑制试验相同，Adr浓度为1μg/mL，以不加葛根素与Adr的细胞作对照组，上述两组不同组合的细胞均置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h，在终止培养前4h加MTT(5mg/mL)20μL/孔，离心弃上清，每孔加DMSO 150μL，振荡，使沉淀完全溶解后用酶标仪570nm处测吸光度(A)。
2.3 RT-PCR检测葛根素作用后MDR1 MRP基因的表达
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2.3.1 总RNA提取 取停药2周后的对数生长期的K562/Adr细胞，在含10%小牛血清和葛根素(终浓度100μg/mL)培养体系中分别培养1周和1个月后，收集足够的细胞进行总RNA提取，提取方法按照Trizol RNA提取试剂操作稍加改进(用Trizol试剂提取2遍)，所提取的总RNA经紫外分光光度计测定260nm和280nm吸光度(A)值及总RNA浓度，A260/A280在1.80以上者用于RT-PCR。分装-80℃保存，备用。
2.3.2 cDNA合成及PCR扩增cDNA合成：20μL逆转录体系中含有：5×逆转录反应缓冲液(5×Bfr)、dNTP、OligodT、RNasin、M-MLV逆转录酶。RNA(60℃溶解10min)1μL、Oligo dT1μL、DEPC Water10μL混匀置于70℃水浴中10min。再加入5×Bfr 5μL、10mM dNTP 2μL、Rnasin 1μL和M-MLV逆转录酶1μL置于37℃水浴70min。
, 百拇医药 PCR扩增：25μL PCR扩增体系包括：10×PCR反应缓冲液2.5μL、10mM dNTP 0.5μL、MgC12 1.5μL、MDR1或MRP 5’端口3’端引物分别1μL、B-actin 5’端和3’端引物分别1μL、Taqase 0.25μL、RT产物2.5μL、DEPC水13.75μL。反应在DNA扩增仪(美国PE公司)上进行。在扩增前均94℃变性5min。根据MDR1、MRP和β-actin相应的GeneBmak的登录号NM_000927、L05628和X00351用Premier Primer 5.0软件设计引物序列，Intemet网上进行Blast同源性比较。以β-actin作为内对照。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增条件为94℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，30个循环；最后用72℃延伸10min。
PCR扩增产物电泳：取扩增产物10μL，在1.0%琼脂糖凝胶(含EB)、1×TAE电泳缓冲液上电泳2h，紫外观察，凝胶图像分析系统分析并拍照保存。
3 统计学处理
数据处理用均数±标准差(x±s)表示，两样本比较采用t检验，以SPSS 10.0 for windows软件包统计分析，以P<0.05为差异显著的标准。
4 结 果
4.1 液体培养葛根素抑制K562/Adr细胞增殖作用, http://www.100md.com(陈小红 高瑞兰 林圣云 王 潇 钱煦岱 于志军)
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关键词：葛根素注射液；MDR1；MRP；K562/Adr细胞株
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)09-1926-03
白血病化疗失败和复发的原因之一就是白血病细胞的耐药性。目前发现白血病细胞的多药耐药(MDR)的产生机制是多因素的，且有不同的耐药表型。因此对于MDR产生的机理及如何克服耐药性问题一直是国内外专家的研究热点。葛根素主要从豆科植物野葛的干燥根中提取、分离而得。具有扩张血管、降血脂血压、改善微循环、抗氧化、抗血栓形成，修复内皮细胞损伤及抑制脑细胞凋亡等药理作用。然而对多药耐药方面研究尚少。本文观察了慢性粒细胞白血病急变细胞株的耐药株K562/Adr在葛根素干预前后对化疗药物的敏感性及作用机制，为揭示白血病细胞耐药机制，寻找有效的逆转耐药药物提供实验依据。
1 材 料
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1.1 细胞系
K562/Adr(耐药株)由中国医学科学院天津血液病研究所提供。K562/Adr为阿霉素(Adr)长期诱导K562敏感株而建立的耐药细胞株。
1.2 试 剂
阿霉素(Adramyein，Adr)为意大利法玛西亚普强公司产品。葛根素注射液购自浙江康恩贝制药股份有限公司，每支5mL(5mL：0.25g)。Tfizol购自lnvitmgen公司。
2 实验方法
2.1 细胞系的培养
耐药株K562/Adr在含2μg/mL阿霉素(Adr)的10%小牛血清RPMI 1640培养液中培养传代，实验前14天K562/Adr在元Adr的1640培养液中培养，取对数生长期的细胞进行实验。
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2.2 MTT法检测细胞增殖和药敏试验
取停药2周后的对数生长期细胞作MTT试验：增殖抑制试验(不同浓度的葛根素对细胞的作用)，每孔 200μL培养体系含10%小牛血清、5×104细胞/mL和不同浓度的葛根素(终浓度分别为：25、50、100、250和500μg/mL)每个浓度作4个平行孔，以不加葛根素的作对照组。化疗药物敏感性试验(葛根素与化疗药物Adr的协同作用)，培养体系含小牛血清、细胞和不同浓度的葛根素均与上述增殖抑制试验相同，Adr浓度为1μg/mL，以不加葛根素与Adr的细胞作对照组，上述两组不同组合的细胞均置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h，在终止培养前4h加MTT(5mg/mL)20μL/孔，离心弃上清，每孔加DMSO 150μL，振荡，使沉淀完全溶解后用酶标仪570nm处测吸光度(A)。
2.3 RT-PCR检测葛根素作用后MDR1 MRP基因的表达
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2.3.1 总RNA提取 取停药2周后的对数生长期的K562/Adr细胞，在含10%小牛血清和葛根素(终浓度100μg/mL)培养体系中分别培养1周和1个月后，收集足够的细胞进行总RNA提取，提取方法按照Trizol RNA提取试剂操作稍加改进(用Trizol试剂提取2遍)，所提取的总RNA经紫外分光光度计测定260nm和280nm吸光度(A)值及总RNA浓度，A260/A280在1.80以上者用于RT-PCR。分装-80℃保存，备用。
2.3.2 cDNA合成及PCR扩增cDNA合成：20μL逆转录体系中含有：5×逆转录反应缓冲液(5×Bfr)、dNTP、OligodT、RNasin、M-MLV逆转录酶。RNA(60℃溶解10min)1μL、Oligo dT1μL、DEPC Water10μL混匀置于70℃水浴中10min。再加入5×Bfr 5μL、10mM dNTP 2μL、Rnasin 1μL和M-MLV逆转录酶1μL置于37℃水浴70min。
, 百拇医药 PCR扩增：25μL PCR扩增体系包括：10×PCR反应缓冲液2.5μL、10mM dNTP 0.5μL、MgC12 1.5μL、MDR1或MRP 5’端口3’端引物分别1μL、B-actin 5’端和3’端引物分别1μL、Taqase 0.25μL、RT产物2.5μL、DEPC水13.75μL。反应在DNA扩增仪(美国PE公司)上进行。在扩增前均94℃变性5min。根据MDR1、MRP和β-actin相应的GeneBmak的登录号NM_000927、L05628和X00351用Premier Primer 5.0软件设计引物序列，Intemet网上进行Blast同源性比较。以β-actin作为内对照。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增条件为94℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，30个循环；最后用72℃延伸10min。
PCR扩增产物电泳：取扩增产物10μL，在1.0%琼脂糖凝胶(含EB)、1×TAE电泳缓冲液上电泳2h，紫外观察，凝胶图像分析系统分析并拍照保存。
3 统计学处理
数据处理用均数±标准差(x±s)表示，两样本比较采用t检验，以SPSS 10.0 for windows软件包统计分析，以P<0.05为差异显著的标准。
4 结 果
4.1 液体培养葛根素抑制K562/Adr细胞增殖作用, http://www.100md.com(陈小红 高瑞兰 林圣云 王 潇 钱煦岱 于志军)