尿酸性肾病大鼠肾组织中TGF-β1CTGF mRNA的表达变化及补肾活血方对其影响(1)
摘要：目的：观察尿酸性肾病大鼠肾脏中TGF-β1、CTGF mRNA表达情况及补肾活血方对其影响，为肾间质纤维化的防治提供依据。方法：采用酵母、腺嘌呤制作尿酸性肾病大鼠模型，采用RT-PCR法，动态观察大鼠肾脏中TGF-β1、CTGF mRNA表达情况及补肾活血方对其影响。结果：造模后，TGF-β1、CTGF mRNA在尿酸性肾病大鼠肾组织中的表达均有所增加，与正常组比较，TGF-β1，mRNA的表达在第1周末无明显变化，P>0.05，第2周后表达明显增加，P1 mRNA表达有不同程度的降低。结论：尿酸性肾病的发生、发展与多种生长因子相互协同作用有关。TGF-β1和CTGF在尿酸性肾病的进展中均起了一定作用，其中CTGF不仅仅是作为TGF-β1的下游因子发挥作用，同时可能也作为平行于TGF-β1的独立因素存在，TGF-β1可能在本病进展中起了比CTGF更重要的作用，对其进行干预，是防治尿酸性肾病肾间质纤维化的重要途径之一。而补肾活血方可降低尿酸性肾病大鼠肾脏中TGF-β1 mRNA表达，可用于肾间质纤维化的防治。
, http://www.100md.com
关键词：转化生长因子；结缔组织生长因子；尿酸性肾病；补肾活血方
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)09-1931-03
尿酸是人体内瞟呤代谢的终末产物，由于嘌呤代谢紊乱，血尿酸生成过多或者排泄减少，即形成高尿酸血症，当尿酸盐在血中的浓度呈过饱和状态时即可沉积于肾脏而引起肾脏损害，称之为尿酸性肾病。笔者应用补肾括血方(枸杞子、杜仲、续断、狗脊、补骨脂、桃仁、制大黄等)为基本方对本病进行治疗取得较好疗效，并从动物实验中得到了进一步验证。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体重200-230g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2003-0002，饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物室，标准饮食，自由饮水，每笼5只，适应性饲养3天后用于实验。
, 百拇医药
1.2 主要药物及试剂 补肾活血方：药材购于上海中医药大学附属龙华医院中药房，由中国科学院上海药物研究所加工制备成提膏，使用时按比例以蒸馏水溶解、稀释，高、低剂量组浓度分别为5.7g(生药)/mL、2.85g(生药)/mL。
别嘌醇片：上海延安万象药业股份有限公司生产，以蒸馏水溶解、稀释为5mg/mL。
酵母、腺嘌呤、琼脂糖：OXOID公司，购自上海百泰化学科技公司。肌酐、尿素氮、尿酸、黄瞟呤氧化酶测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。RNA Trizol一步法提取试剂盒、DNA Ladder：北京鼎国生物技术责任有限公司。EDTA、Tris、硼酸、溴化乙啶、溴酚蓝、二甲苯青、焦碳酸二乙酯：sigma公司分装，购自上海申能博彩生物技术有限公司。PCR引物：参照Genebank基因序列，由上海申能博彩生物技术有限公司合成。
2 实验方法
, 百拇医药
2.1 分组与造模 取大鼠69只，随机分为5组，其中正常组15只、模型组30只、别嘌醇组8只、补肾活血方高剂量组8只、补肾活血方低剂量组8只，正常组动物给予普通全价饲料，其余动物予以含10%酵母干粉的饲料(将酵母干粉均匀拌入粉碎的大鼠颗粒饲料中，重新压制成型，酵母干粉含量为10%)喂养，控制酵母的每日摄入量为10g/kg，并予以腺瞟呤100mg(kg·d)灌胃。
2.2 给药剂量 正常组、模型组予以蒸馏水灌胃，别嘌醇组、高剂量组、低剂量组分别于造模同时予以别嘌醇[50mg/(kg·d)]、高剂量补肾活血方[57g生药/(kg·d)]、低剂量补肾活血方[28.5g生药/(kg·d)]灌胃，灌胃体积均为1mL/(100g·d)，各组动物自由饮水，共35天。
2.3 标本留取第1、3、5周结束时，随机取正常组动物5只，禁食不禁水12h，然后腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，腹主动脉取血，分离血清，-20℃冰箱保存备用；摘取双侧肾脏，迅速称重后，右侧肾脏及1/2左侧肾脏迅速置于液氮中，转入-80℃冰箱保存备用，剩余1/2肾脏投入福尔马林液中固定。前4周每周结束时，同样方法处死模型组动物各5只。第5周结束时，将剩余动物全部处死，方法同前。
, 百拇医药
2.4 检测方法 各项生化指标检测采用比色法，试剂盒购于南京建成生物公司。
TGF-β1、CTGF mRNA表达：RT-PCR法，凝胶电泳结束后，FR-200紫外与可见光分析系统拍照，并进行电泳条带光密度(灰度)分析。为消除系统及定量误差，各组mRNA表达水平以相对表达量即目的基因/β-actin的灰度比值来计算。
3 统计学处理
采用SPSS Version 11.0 for Windows进行数据统计，以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用One-WayANOVA分析，统计显著性水平为P<0.05。
4 结 果
4.1 一般情况 正常组大鼠体重增长明显，精神状况良好，动作自如，反应灵敏，体毛有光泽；模型组大鼠体重减轻，多饮、多尿，体毛干枯、脱落、欠光泽，精神萎靡，活动减少；各给药组动物诸情况相对模型组为轻。
, http://www.100md.com
4.2 死亡情况 实验过程中，正常组大鼠无死亡，模型组大鼠死亡3只，别嘌醇组、高剂量组、低剂量组各死亡1只，无统计学意义。
4.3 补肾活血方对大鼠各项生化指标变化的影响 与正常组比较，模型大鼠从第1周末即开始出现血尿素氮浓度增高及黄嘌呤氧化酶活性增强，分别P<0.05和P<0.01；血清尿酸浓度于第2周末在数值上升高，但无统计学意义，第4周末出现统计学意义，P<0.05；血清肌酐浓度于第4周末出现显著升高，P<0.01。
予以相应药物治疗后，与正常组比较，给药组大鼠各项生化指标虽仍处于较高水平，P<0.05或P<0.01；但与模型组比较，已有不同程度的降低，其中，各组动物血尿酸浓度均明显降低，P<0.01；血肌酐浓度以补肾活血方高剂量组降低更为明显，P<0.01；黄嘌呤氧化酶活性以别嘌醇组和补肾活血方高剂量组下降更显著，P<0.01，尿素氮浓度各组无明显变化，P>0.05。
4.4 补肾活血方对大鼠肾组织中TGF-β1CTGF mRNA表达变化的影响造模后，TGF-β1、CTGF mRNA在尿酸性肾, 百拇医药(高志卿 张 宾 张 俊 陈以平)
, http://www.100md.com
关键词：转化生长因子；结缔组织生长因子；尿酸性肾病；补肾活血方
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)09-1931-03
尿酸是人体内瞟呤代谢的终末产物，由于嘌呤代谢紊乱，血尿酸生成过多或者排泄减少，即形成高尿酸血症，当尿酸盐在血中的浓度呈过饱和状态时即可沉积于肾脏而引起肾脏损害，称之为尿酸性肾病。笔者应用补肾括血方(枸杞子、杜仲、续断、狗脊、补骨脂、桃仁、制大黄等)为基本方对本病进行治疗取得较好疗效，并从动物实验中得到了进一步验证。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体重200-230g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2003-0002，饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物室，标准饮食，自由饮水，每笼5只，适应性饲养3天后用于实验。
, 百拇医药
1.2 主要药物及试剂 补肾活血方：药材购于上海中医药大学附属龙华医院中药房，由中国科学院上海药物研究所加工制备成提膏，使用时按比例以蒸馏水溶解、稀释，高、低剂量组浓度分别为5.7g(生药)/mL、2.85g(生药)/mL。
别嘌醇片：上海延安万象药业股份有限公司生产，以蒸馏水溶解、稀释为5mg/mL。
酵母、腺嘌呤、琼脂糖：OXOID公司，购自上海百泰化学科技公司。肌酐、尿素氮、尿酸、黄瞟呤氧化酶测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。RNA Trizol一步法提取试剂盒、DNA Ladder：北京鼎国生物技术责任有限公司。EDTA、Tris、硼酸、溴化乙啶、溴酚蓝、二甲苯青、焦碳酸二乙酯：sigma公司分装，购自上海申能博彩生物技术有限公司。PCR引物：参照Genebank基因序列，由上海申能博彩生物技术有限公司合成。
2 实验方法
, 百拇医药
2.1 分组与造模 取大鼠69只，随机分为5组，其中正常组15只、模型组30只、别嘌醇组8只、补肾活血方高剂量组8只、补肾活血方低剂量组8只，正常组动物给予普通全价饲料，其余动物予以含10%酵母干粉的饲料(将酵母干粉均匀拌入粉碎的大鼠颗粒饲料中，重新压制成型，酵母干粉含量为10%)喂养，控制酵母的每日摄入量为10g/kg，并予以腺瞟呤100mg(kg·d)灌胃。
2.2 给药剂量 正常组、模型组予以蒸馏水灌胃，别嘌醇组、高剂量组、低剂量组分别于造模同时予以别嘌醇[50mg/(kg·d)]、高剂量补肾活血方[57g生药/(kg·d)]、低剂量补肾活血方[28.5g生药/(kg·d)]灌胃，灌胃体积均为1mL/(100g·d)，各组动物自由饮水，共35天。
2.3 标本留取第1、3、5周结束时，随机取正常组动物5只，禁食不禁水12h，然后腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，腹主动脉取血，分离血清，-20℃冰箱保存备用；摘取双侧肾脏，迅速称重后，右侧肾脏及1/2左侧肾脏迅速置于液氮中，转入-80℃冰箱保存备用，剩余1/2肾脏投入福尔马林液中固定。前4周每周结束时，同样方法处死模型组动物各5只。第5周结束时，将剩余动物全部处死，方法同前。
, 百拇医药
2.4 检测方法 各项生化指标检测采用比色法，试剂盒购于南京建成生物公司。
TGF-β1、CTGF mRNA表达：RT-PCR法，凝胶电泳结束后，FR-200紫外与可见光分析系统拍照，并进行电泳条带光密度(灰度)分析。为消除系统及定量误差，各组mRNA表达水平以相对表达量即目的基因/β-actin的灰度比值来计算。
3 统计学处理
采用SPSS Version 11.0 for Windows进行数据统计，以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用One-WayANOVA分析，统计显著性水平为P<0.05。
4 结 果
4.1 一般情况 正常组大鼠体重增长明显，精神状况良好，动作自如，反应灵敏，体毛有光泽；模型组大鼠体重减轻，多饮、多尿，体毛干枯、脱落、欠光泽，精神萎靡，活动减少；各给药组动物诸情况相对模型组为轻。
, http://www.100md.com
4.2 死亡情况 实验过程中，正常组大鼠无死亡，模型组大鼠死亡3只，别嘌醇组、高剂量组、低剂量组各死亡1只，无统计学意义。
4.3 补肾活血方对大鼠各项生化指标变化的影响 与正常组比较，模型大鼠从第1周末即开始出现血尿素氮浓度增高及黄嘌呤氧化酶活性增强，分别P<0.05和P<0.01；血清尿酸浓度于第2周末在数值上升高，但无统计学意义，第4周末出现统计学意义，P<0.05；血清肌酐浓度于第4周末出现显著升高，P<0.01。
予以相应药物治疗后，与正常组比较，给药组大鼠各项生化指标虽仍处于较高水平，P<0.05或P<0.01；但与模型组比较，已有不同程度的降低，其中，各组动物血尿酸浓度均明显降低，P<0.01；血肌酐浓度以补肾活血方高剂量组降低更为明显，P<0.01；黄嘌呤氧化酶活性以别嘌醇组和补肾活血方高剂量组下降更显著，P<0.01，尿素氮浓度各组无明显变化，P>0.05。
4.4 补肾活血方对大鼠肾组织中TGF-β1CTGF mRNA表达变化的影响造模后，TGF-β1、CTGF mRNA在尿酸性肾, 百拇医药(高志卿 张 宾 张 俊 陈以平)