鳖甲防治肝纤维化实验研究(2)
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参见附件。
1材料与方法
1.1动物实验和分组雄性SD大鼠110只，体重(200±20)g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，随机分为6组：正常对照组10只，CCl4模型对照组、鳖甲煎煮液预防组和治疗组、鳖甲微粉预防组和治疗组各20只。模型组与预防、治疗组以40%CCl4 0.30mL/100g体重背部皮下注射，2次/周，共12周；正常对照组给予等量等渗盐水背部皮下注射。每周末处死造模而未用药物处理的大鼠5只观察肝组织病理改变。实验第4周末，中等度肝纤维化形成(纤维隔形成并互相连接，深入小叶内，小叶结构保留或紊乱，但无肝硬化)。药物预防组于造模同期分别给以鳖甲微粉煎煮混悬液、鳖甲微粉混悬液0.18g生药/100g体重灌胃，1次/日；药物治疗组于造模第5周开始给以上述药液灌胃。正常对照组与模型对照组给予生理盐水1mL/100g体重灌胃，1次/日。实验12周末，各组随机取10只大鼠，2%戊巴比妥钠麻醉后，心脏采血，分离血清备检；冰等渗盐水原位洗涤肝脏，分别用中性10%甲醛、2.5%戊二醛固定及-70℃冻存备检。
1.2病理检查肝组织标本用中性10%甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，常规作HE染色、天狼红染色，观察组织学变化，将肝纤维化分为0~Ⅳ级；按《肝纤维化诊断及疗效评估共识》[1]进行肝纤维化组织学半定量计分系统(SSS)标准计分；肝胶原含量测定参考Jimenez等[2]报道的测试方法，计算方法如下：胶原μg/切片(cm2)=(A540nm-7.78%A630nm)×1000/37。
1.3免疫组化α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF- BB)、Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原(ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ)、层黏蛋白(LN)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)抗体 (博士德公司)和核因子-κB(NF-κB)p65抗体(Santa Cruz公司)；α-SMA和NF-κB p65-抗为鼠抗 ......
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