榄香烯抑制尾加压素-II诱导的人晶状体上皮细胞增殖的信号转导机制(3)
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3.3Ele对HLEC内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响表3显示:U-II组与对照组比较[Ca2+]i显著升高(P<0.001);Ele组与U-II组比较[Ca2+]i显著升高(P<0.001)。
3.4Ele对HLEC内cAMP和cGMP浓度的影响表4显示:U-II组cAMP浓度与对照组比较显著降低(P<0.001),Ele组cAMP浓度与U-II组比较显著升高(P<0.001);U-II组cGMP浓度与对照组比较显著升高(P<0.001),Ele组cGMP浓度与U-II组比较显著降低(P<0.001)。
4讨论
4.1Ele能下调HLEC内PCNA蛋白表达 抑制U-II诱导的HLEC增殖近年来有学者的研究发现,U-II对多种类型的细胞有促增殖作用。有研究[7]发现U-II具有促丝裂效应,能促进实验大鼠多种细胞,如心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)发生增殖。还有研究发现肾上腺髓质素、降钙素基因相关肽等均能浓度依赖性地抑制U-Ⅱ诱导的VSMC增殖[6,8]。本课题的研究也曾发现U-II能显著诱导牛LEC发生增殖,提出这可能是白内障手术后残留的LEC增殖并移行至后囊下发生后发性白内障的发病机制(另文报道)。
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已有报道Ele能抑制多种细胞增殖。Ele是从姜科植物莪术、郁金中提取的一种倍半萜烯类衍生物[1]。Ele可能通过抑制细胞周期蛋白磷酸化来调控G1/S关卡,从而抑制肝星状细胞增殖并促进其凋亡[2];也有研究发现Ele可抑制血管内皮生长因子诱导的牛视网膜色素上皮细胞的DNA合成,从而抑制细胞增殖,提示Ele可能在治疗血管增殖性视网膜病变中具有潜在的临床价值[3]。本课题组的前期研究表明Ele可抑制重组人表皮生长因子诱导的牛LEC增殖[4]。但有关Ele抑制U-II诱导的HLEC增殖的作用,国内外文献尚未见报道。
PCNA是一种与细胞增殖有关的、参与DNA合成的、稳定的细胞周期相关性核蛋白,能较可靠的反映细胞群体的增殖活性。近年来,有关于Ele对细胞内PCNA表达影响的报道,发现β-榄香烯可下调PCNA表达、降低DNA合成及多倍体比率,从而抑制大鼠胃黏膜增殖活性[28]。但Ele下调LEC内PCNA表达从而抑制细胞增殖的研究尚未见报道。
本研究采用MTT法检测HLEC活性、FCM检测HLEC内PCNA蛋白表达。结果发现U-II组HLEC活性增高;PCNA蛋白表达率较对照组显著升高,高、中、低不同浓度的Ele组的PCNA蛋白表达率均较U-II组显著降低,Ele能显著抑制U-II促进的HLEC增殖,且呈浓度依赖关系。本实验结果说明:U-II可能通过上调HLEC内PCNA蛋白表达而促进细胞增殖、参与后发性白内障的发生。高、中、低不同浓度的Ele能下调HLEC内PCNA蛋白表达,使参与DNA合成的PCNA被抑制,从而使DNA合成受阻,影响细胞增殖周期,这可能是Ele抑制U-II促进的HLEC增殖的一种机制。该结果为开发防治后发性白内障的有效药物提供了科学的实验依据。
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4.2HLEC[Ca2+]i信号转导是Ele对U-II诱导增殖的抑制作用的信号转导机制之一Ca2+信号转导途径处于多种细胞信息传递途径的中心位置。Ca2+作为重要的细胞内第二信使,在细胞增殖等方面发挥重要的作用。Ca2+在细胞内发挥生理作用需要与蛋白结合,其中钙调蛋白(Calmodulin,CaM)最为重要[9]。当细胞受到外来刺激后,可引起细胞内[Ca2+]i的变化,Ca2+与CaM结合,形成Ca2+-CaM复合物,激活一系列蛋白激酶,促使蛋白质磷酸化,从而参与对细胞增殖的调节。
有研究表明U-II促细胞增殖作用与其刺激胞内[Ca2+]i升高及Ca2+介导的信号转导通路密切相关。钙通道阻断剂尼卡地平能部分抑制U-II的促细胞增殖效应,表明U-II促丝裂作用部分是由胞外Ca2+内流所介导。目前认为U-II与GPR14结合,通过电压依赖性和电压非依赖性钙通道促进Ca2+内流,引起胞内Ca2+增加而发挥生物学效应[10-11]。本课题组的前期研究发现U-Ⅱ能显著地促进牛LEC增殖,且PKC\\MAPK\\CaM\\钙通道阻断剂可抑制U-II对牛LEC的增殖作用,该结果将另文报道。
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本研究发现U-II组HLEC [Ca2+]i较对照组显著升高(P<0.001),表明Ca2+可能参与了U-II诱导的HLEC增殖过程。进一步的研究结果发现Ele能使HLEC [Ca2+]i较U-II组进一步升高(P<0.001)。提示Ele可能通过使HLEC [Ca2+]i持续升高而发挥抑制U-II诱导的HLEC增殖的信号转导作用,从而揭示了Ele抑制U-II诱导HLEC增殖的信号转导机制。
4.3HLEC内cAMP和cGMP信号转导是Ele对U-II诱导增殖的抑制作用的另一信号转导机制cAMP和cGMP信号系统是细胞内重要的信息传递通路,在调节细胞的生长和分裂中起着至关重要的作用。有研究认为cAMP激活PKA(Protein kinase A,PKA),进而抑制p21 ras下游的p2l ras分裂原,激活蛋白激酶信号传递途径,从而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖[12]。肾上腺髓质素和降钙素基因相关肽可能通过增加cAMP、抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)的激活,从而抑制U-II的促VSMC增殖效应[6,8]。cGMP可激活cGMP依赖蛋白激酶即蛋白激酶G(Protein kinase G,PKG),实现其对细胞的多种生物学效应。当cGMP浓度升高时,可促进细胞内核酸和组蛋白合成,加速细胞分裂,提高细胞增殖水平。cGMP在细胞内含量很少,通常只有cAMP的l/10-1/50,但发挥着重要的调节细胞增殖的作用。可见cAMP与cGMP的作用互相拮抗,cAMP/cGMP的比值被认为可作为细胞生长代谢和增殖的指标[13]。
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经查阅国内外文献,有关U-II与HLEC内cAMP、cGMP生物学效应的关系尚未见报道。也未见Ele对HLEC内cAMP、cGMP影响的报道。本研究结果发现,U-II组cAMP浓度较对照组显著降低,而cGMP浓度较对照组显著升高。表明U-II可能通过降低HLEC内cAMP浓度,减弱cAMP的抗增殖作用;通过升高cGMP浓度,促进核酸和组蛋白的合成,最终诱导HLEC增殖。本研究进一步发现Ele使HLEC内cAMP浓度较U-II组显著升高,cGMP浓度较U-II组显著降低。表明Ele可能在细胞周期的某一过程通过使胞内cAMP浓度增高,进而激活PKA,使靶蛋白上的丝氨酸和苏氨酸磷酸化,从而发挥抑制U-II所诱导的HLEC增殖的作用。与此同时,Ele可能通过降低细胞内cGMP浓度,干预cGMP-PKG信号转导途径,影响细胞周期进程,抑制DNA合成,从而拮抗U-II对HLEC的增殖效应。这说明cAMP-PKA和cGMP-PKG信号转导途径很可能参与调控Ele抑制U-II诱导HLEC增殖的作用。, 百拇医药(祁明信 黄秀榕 胡 俊 杨丽英)