活血利水法对外伤性增生性玻璃体视网膜病变模型兔眼IGF-1表达的影响(2)
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Key words:method of activating blood and dieresis; SXMM tablet; traumatic proliferative vitreoretinopathy; insulinlike growth factor-1
外伤性增生性玻璃体视网膜病变(traumtic proliferative vitreoretino- pathy,tPVR)是指发生孔源性视网膜脱离及穿通性眼外伤后,因创伤修复的过度瘢痕化所引起的牵引性视网膜脱离。在炎症刺激下的纤维组织增生和玻璃体或视网膜在伤口的嵌顿,是其主要的发病机制。tPVR在祖国医学中可归属于“暴盲”、“云雾移睛”或“视瞻昏渺”等范畴,属于“外不见证,从内而蔽”的内障眼病。笔者导师结合长期临床实践,研制出具有活血利水之功效的散血明目片,不仅在临床取得了良好的疗效,且通过严谨的科学实验证实其对兔视网膜具有保护作用。本课题将进一步研究活血利水法对实验性t-PVR模型兔眼胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)浓度的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物
有色家兔40只,雌雄各半,体质量2.0～2.5kg,经检查无眼疾,由湖南中医药大学动物实验中心提供。
1.2 药物及试剂
散血明目片:由三七、酒大黄、蒲黄、防己、猪苓等活血通脉利水明目中药按现代制剂制备工艺制成,0.3g/片,选用同一批号药物,批号:020624。由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。使用时研成粉末,温开水混合,浓度为100mL含散血明目片12g的混悬液。
止血祛瘀明目片:由丹参、三七、赤芍、地黄、墨旱莲、茺蔚子、牡丹皮、女贞子、夏枯草、毛冬青、大黄、黄芩(酒炙)等制成,薄膜衣片每片重0.3g,选用同一批号药物,批号:国药准字Z20025316。由陕西摩美得制药有限公司生产。使用时研成粉末,温开水混合,浓度为每100mL含止血祛瘀明目片12g的混悬液。
猪苓散加减:猪苓10g,泽泻10g,茯苓15g,狗脊10g,大黄10g,栀子10g,滑石10g,车前子15g。原方出自《审视瑶函》。使用时煎成汤剂,浓度为100mL含生药130g。
兔抗IGF-1试剂盒:由武汉博士德生物工程有限公司提供,编号:PR2318。
1.3 造模方法
参照万光明等[1]提出的方法,并加以改进。
1.3.1 富含血小板的血浆(platelet-rich plasma,PRP)的制备 用含3.8%枸橼酸钠的玻璃离心管收集健康有色家兔耳缘静脉血(静脉血与枸橼酸钠体积比为9∶1),轻轻摇动混匀,室温下以3000r/min离心5min,取上1/3之上清液,进行血小板计数,获得血小板浓度为5×105～10×105/mL的血浆,即PRP[1]。
1.3.2 有色家兔32只,1%阿托品眼水充分散瞳后,耳缘静脉注射25%乌拉坦4mL/kg。每只兔右眼为实验眼,颞上方注入透明质酸酶0.1mL并反复抽吸,再分离3～9点的球结膜和筋膜,在角膜缘后6mm处用巩膜穿刺刀刺向玻璃体中心部,勿伤及晶状体及周边视网膜,用剪刀向两侧扩大切口,伤口与角膜缘平行达8mm。轻压眼球,将脱离的玻璃体剪除,用8-0尼龙线间断缝合切口。玻璃体腔中央注入0.1mL的PRP(约含70000个血小板)。术毕予地塞米松10mg+庆大霉素2万U各0.1mL球结膜下注射。造模后一周内用0.3%诺氟沙星滴眼药滴右眼,3次/天,0.5%托吡咔胺滴右眼,3次/天。
1.4 动物分组
健康有色家兔40只,随机抽取8只(8只眼)为空白组(A组),其余32只(32只眼)造成右眼tPVR模型,并随机分为模型组(B组)、利水明目组(C组、用猪苓散)、活血化瘀组(D组、用止血祛瘀明目片)、活血利水组(E组、用散血明目片),每组均为8只(8只眼)。
1.5 给药方法及标本采集
造模后第2天开始给药,A组与B组均予温开水灌胃,5mL/kg,2次/天。C组(利水明目组)予猪苓散灌胃6.5g/(5mL•kg)(每mL含生药1.3g),2次/天,均相当于成人剂量。D组用(止血祛瘀明目片组)1.2g/(5mL•kg),用时研成粉末,温开水混合灌胃,2次/天,均相当于成人剂量。E组予散血明目片混悬液,按0.6g/(5mL•kg)灌胃, 2次/天。各组均灌胃28天后用空气栓塞法处死动物,即行眼球摘除术,并在上极象限作球冠形开窗,观察增殖膜分级情况后,剔除角膜和眼内容物,以造模时的巩膜切口为分界将眼球壁分为两半,取一半眼球壁,立即置于4%的多聚甲醛溶液中,保存于4℃下固定,以备组织观察。另一半眼球壁标本小心剥离视网膜及增殖膜组织,置于液氮灌冰冻保存,待测IGF-1。
1.6 观察指标与方法
1.6.1 PVR 分级 用直接检眼镜检查,观察PVR 分级,采用 Weiss 的评级方法[2],将病变分为六级:0 级:无增生;05 级:玻璃体勉强可见增生痕迹;1 级:细小的增生束,但无真正的条索形成;2 级:有浓厚的增生束,但无真正的增生条索形成;3 级:有细薄的增生条索;4 级:有浓厚的增生条索。
1.6.2 增殖膜IGF-1的测定 将固定后的眼球壁标本沿矢状面分一半脱水后石蜡包埋,切片,切片厚4μm,经苏木素伊红染色(HE) ,封片后镜检,显微摄影;将另一半眼球壁标本同样脱水、石蜡包埋、切片,然后以免疫组化法进行IGF-1的检测:石蜡切片4μm,常规脱蜡和水化,3%H2O2室温处理10min;微波炉热修复抗原;正常山羊血清封闭30min,吸取多余液体,不洗,滴加1∶100稀释的兔抗IGF-1抗体;滴加生物素化羊抗兔IgG;滴加SABC;每一步之间用0.1mol/LPBS充分洗涤。最后,显微镜下控制DAB显色时间,苏木素复染,脱水,透明,封片。具体步骤按照试剂盒说明进行,阴性对照用PBS代替一抗。DAB显色,光镜下胞浆呈棕黄色颗粒者为阳性。用显微图象分析仪对切片进行图像分析,所有切片均在同一放大倍数(10×40)及同一光强度下分析,测量阳性染色区域,每例动物测10张切片,取平均值。观察指标:①平均光密度;②阳性产物平均灰度值(系统设定白色最大灰度为256,黑色最小灰度为0) ......
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