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编号:12170549
响应面优化酶法提取平菇多糖工艺研究(2)
http://www.100md.com 2011年3月1日 钱磊,张春椿,蒋剑平,熊耀康
    参见附件(12kb)。

     2.2.2 供试品溶液的制备 将“2.1”所得的多糖沉淀加水溶解,定容至100mL容量瓶中,摇匀,精密量取1 mL,定容至25mL容量瓶中,摇匀,作为供试品溶液。

    2.2.3 最大吸收波长的确定 吸取一定量的标准葡萄糖对照品溶液,置于比色管中,加水至2mL,加1mL 5%苯酚后,立即加入5mL浓硫酸混匀,静止10min,摇匀,室温放置20min。同时取2mL水同法操作,作为空白对照。样品溶液分别于450~550nm处测吸光度,确定其最大吸收波长。根据预实验结果,吸收波长为490nm时,样品溶液的吸光度最大,故本实验选取的吸收波长为490nm。

    2.2.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL于比色管中,各以水补至2.0mL后加入5 %苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL,混匀,静止10min,摇匀,室温放置20min后于490nm测定吸光度,以2.0mL水按同样显色操作为空白对照,以多糖浓度为横坐标,测定的吸光度值为纵坐标,得标准曲线y6.6964x+0.0084,r0.9995。表明葡萄糖检测浓度在0.008~0.072mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

    2.2.5 精密度试验 精密吸取葡萄糖标准溶液1.0mL,自“以水补至2.0mL”起按“2.2.4”操作,重复测定6次,结果吸光度的RSD为0.67%(n6),表明仪器精密度良好。

    2.2.6 稳定性试验 精密吸取葡萄糖标准品溶液和供试品溶液各1.0mL,自“以水补至2.0mL”起按“2.2.4”操作,1h内每隔10min于490nm处测定吸光度。结果对照品和样品吸光度的RSD分别为0.69%和0.75%,表明对照品溶液和样品溶液在显色后1h内稳定。

    2.2.7 重复性试验 将多糖沉淀加水溶解后定容至100mL容量瓶中,摇匀,按“2.2.2”项配制供试品6份,各精密吸取1.0mL,自“以水补至2.0mL”按“2.2.4”操作,分别测定吸光度,结果吸光度的RSD为0.55%(n6),表明该法重复性良好。

    2.2.8 加样回收率试验 将多糖沉淀加水溶解后定容至100mL容量瓶中,摇匀,按“2.2.2”项配制供试品9份,各精密吸取0.5mL供试品溶液,分别加入葡糖糖含量是供试品溶液80%、100%、120%的对照品溶液,自“以水补至2.0mL”起按“2.2.4”操作测定吸光度,计算回收率。结果见表1。平均回收率为99.60%,RSD为1.57%,表明方法的准确性良好。

    表1 加样回收率试验结果

    2.3 提取条件优化

    根据单因素考察结果以及文献报道[9],选取酶解时间、酶解温度、pH3项作为考察因素,采用3因素3水平的响应面分析法进行试验,以多糖得率为检测指标,优化提取条件。具体因素水平及实验结果见表2、表3、表4及图1~6。

    表2 响应面分析因素与水平

    表3 响应面分析方案及结果

    注:共有15个实验,其中12个是析因实验,3个为中心实验以估计误差。

    各因素经回归拟合后,解得回归方程为:Y6.68+0.084X1-0.18X2+0.13 X3-0.18 X1X2+0.17 X1X3+0.33X2X3-0.20X12-0.49X22-0.18X32

    式中,Y为多糖得率(%),X1为酶解时间(min),X2为酶解温度(℃),X3为pH。

    回归分析结果如表3所示,当“Prob>F”值小于0.05即表示该项指标显著,从表3的分析结果来看,整体模型的“Prob>F”值小于0.01,表明该模拟二次方程高度显著,说明这种实验方法是可靠的,使用该方程模拟真实的3因素3水平的分析是可行的。由表3的“Prob>F”值可以知道,在所选的各因素水平范围内,对结果的影响排序为:酶解温度>pH>酶解时间。其中,X2、X2X3和X22对Y的影响非常显著,X3、X1X2、X1X3 、X12和X32对Y的影响显著 ......

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