脂肪干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定(2)
1.3 AKP定量检测 将底物 40mg(1粒)溶解于10mL去离子水中备用；取5支15mL离心管分别标记空白等，各放入0.5mL缓冲液和0.5mL底物水溶液，37℃水浴10min；每盘细胞PBS冲洗后，加入3mL Tris (ph7.4)，将细胞刮下，吸入离心管，超声震荡粉碎(90s,间隔9s, 4℃)；取01mL混合震荡液加入已标记的离心管中，空白组加入0.1 mL去离子水，继续37℃水浴15min；加入10mL 0.05N NAOH终止，405nm分光光度计测光密度值(吸光度)，以空白对照组进行调零。(0.0815OD值=1 Sigma U，1 Sigma U=1μmol p-nitrophenol/h)。1.4 细胞免疫荧光分析OPN 、OCN 及I型胶原表达 细胞爬片经PBS冲洗两遍，每次5min，加入95%丙酮固定10min，PBS适当冲洗，10%羊血清封闭30min，加一抗(OPN、I型胶原为兔抗人多克隆抗体，OCN为鼠抗人单克隆抗体)4°C过夜，PBS适当冲洗，二抗(OPN、I型胶原FITC标羊抗兔多克隆抗体，OCN为FITC标羊抗鼠多克隆抗体)37°C孵育30min，PBS适当冲洗，1∶ 1000稀释PI(Sigma公司)37°C孵育10min，PBS漂洗后封片，荧光显微镜观察 ......
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