清热养阴活血法对糖尿病大鼠心肌细胞VEGF表达和超微结构的影响(2)
1.2 动物
清洁级纯种Wistar大鼠，体重180～220g，雌雄各半，共90只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。
1.3 仪器
华中科技大学同济医学院千屏影像工程公司HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统：IBM兼容机、中科院自动化研究所CAA-P530图像分析卡、HV-720型日立摄像机、SONY监视器、HB-Ⅱ型OLYMPUS普通光学显微镜HITACHI。
1.4 实验方法
1.4.1 模型制作及给药方法 随机选取12只大鼠作为正常对照组，测空腹血糖平均值为4.13mmol/L，其余78只禁食12h后，按50mg/kg体重一次性尾静脉注射STZ，72h后测定大鼠空腹血糖>16.65mmol/L且<33.3mmol/L者视为造模成功\[3\]，共76只，其余2只淘汰。将DM大鼠按血糖值高低随机分为5组：模型组、胰岛素组、胰岛素+逐瘀化消饮低剂量组(简称逐瘀化消饮L组)、胰岛素+逐瘀化消饮中剂量组(简称逐瘀化消饮M组)、胰岛素+逐瘀化消饮高剂量组(简称逐瘀化消饮H组)。每组15只(模型组16只)，加上正常对照组12只，共88只。正常组、模型组灌服生理盐水4mL，胰岛素组皮下注射长效胰岛素1～2u，逐瘀化消饮L、M、H组皮下注射长效胰岛素1～2u+灌服逐瘀化消饮0.75g/mL、1.5g/mL、2.0g/mL各4mL。上述六组均每日灌胃1次，治疗周期8周。实验结束时模型组、胰岛素组、逐瘀化消饮L组、逐瘀化消饮M组、逐瘀化消饮H组死亡动物只数分别为8、4、2、2、3只。
, 百拇医药
1.4.2 标本采集、取材及检测 治疗第3周末、第6周末及实验结束时禁食、不禁水12h称体重，剪尾尖取血用One TouchⅡ血糖仪测定空腹血糖。
治疗8周后，禁食不禁水12h，断头处死动物，取心脏约0.5mm3～1mm3大小的组织块入10 %中性福尔马林溶液固定。
正常组、模型组、胰岛素组、逐瘀化消饮低剂量组随机选3只动物断头处死，立即取心脏。在房室瓣环水平下约2mm处，切取约1mm×1mm×1mm厚之左右两心室相连的横截面心肌组织3块，入2.5%戊二醛的有盖安瓿瓶中固定。
(1)电镜标本制备：上述心肌组织入2.5%戊二醛中预固定1～2h，1%四氧化锇后固定2h，梯度乙醇脱水，包埋剂渗透包埋，超薄切片机切成厚50～80μm超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅等重金属电子双重染色后，置于H-600透射电镜下观察，摄像。
, 百拇医药 (2)VEGF切片制备及观察：10%中性福尔马林固定组织块6h后，常规石蜡包埋，切片厚4μm。
常规免疫组化染色后在普通光学显微镜下观察，摄像，染色结果判定标准：以细胞胞浆中染色呈棕黄色颗粒为阳性表达，不着色为阴性。VEGF定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，每张切片在高倍镜下(×400)随机选取10个视野，在同一条件下测定视野内心肌组织中VEGF含量，结果以平均光密度值(A)表示，并摄像。
1.5 统计分析
实验数据用±s表示，采用计算机统计软件SPSS 110进行统计分析。
2 结 果
2.1 各组大鼠空腹血糖(FBG)的比较
治疗3、6、8周各治疗组FBG明显下降，无显著性差异。治疗期间各治疗组血糖值自身比较无显著性差异。治疗前后比较，各治疗组均有显著性差异(P<0.01)。见表1。
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注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01；与胰岛素组相比，●P<0.05，●●P<001。
经HPIAS-1000图像分析，与正常组相比，心肌组织中VEGF表达模型组平均光密度值有非常显著性差异(P<001)，胰岛素组有显著性差异(P<0.05)，逐瘀化消饮各组无统计学意义。与模型组相比，各治疗组心肌组织中VEGF平均光密度值均低，胰岛素组有显著性差异(P<0.05)，逐瘀化消饮低、中、高剂量组均有非常显著性差异(P<0.01)。与胰岛素组相比，逐瘀化消饮低、中、高剂量组心肌组织中VEGF平均光密度值低，在低、中剂量组有非常显著性差异(P<0.01)，高剂量组有显著性差异(P<005)。
2.3 电镜观察大鼠心肌超微结构
电镜下可见模型组心肌纤维明暗带不清晰，部分肌节明带增宽， PAS阳性物质沉着；线粒体外形不规则，或增大有空泡样变并可见髓鞘样小体，或线粒体缩小，部分线粒体基质密度增加；横切、纵切面大量胶原纤维增生。胰岛素组：心肌纤维明暗带可见，部分线粒体膜不完整，融合，嵴模糊；可见明显胶原纤维增生；心肌细胞核膜完整，染色质分布尚均匀，线粒体形态均匀，部分线粒体嵴模糊不清，肌节明暗带可辨；逐瘀化消饮低剂量组心肌纤维明暗带尚清晰，部分肌纤维明带略有增宽，线粒体膜完整，形态规则，嵴丰富而长；有胶原纤维增生。心肌细胞核间隙增宽，染色质分布不均匀，边集，线粒体膜完整，嵴方向不规则；肌节明带稍增宽，可见局部肌丝断裂。
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3 讨 论
VEGF也称为血管通透因子，是从牛脑垂体滤泡星状细胞和条件培养基中纯化出来，具有肝素结合活性的、分子量为34~46ku的二聚体糖蛋白\[4\]。它是一种特异性的作用于血管内皮细胞的多功能因子，可以促进内皮细胞增殖、分裂，诱导新生血管形成\[5\]。
VEGF参与体内多种疾病的病理生理过程，一系列生长因子、细胞因子、激素，如转化生长因子、血小板源性生长因子、纤维母细胞生长因子、内皮生长因子、前列腺素E及缺氧都可增加VEGF的转录。VEGF不仅作用于内皮细胞，而且对血管平滑肌细胞、心肌细胞等都有一定的效应\[6\]。
VEGF本身对局部血流动力学并无影响\[7\]，但可促进内皮细胞前列环素、一氧化氮、内皮素-1和Von Willebrand 因子的产生\[8\]，从而增强血管的通透性。VEGF可刺激内皮细胞增殖及分化，增加血管通透性，参与生理及病理的血管发生，调节依赖于内皮组织的血管舒张，而且作为内皮细胞存活因子，可诱导内皮细胞产生抗细胞凋亡蛋白\[9\]。
, 百拇医药
以往国内外人体和动物实验已证实\[10\]：DM可导致心脏重量增加，心肌细胞肥大，肌纤维断裂，肌丝扭曲，线粒体增多，变性肿胀，基质空泡变性呈水样变，细胞内糖原颗粒沉积。近年来不断增多的有关DM心肌病变的实验研究\[11-14\]，表明了心肌细胞超微结构的改变存在于DM早期，是DM心肌病的病理基础。
线粒体的数量、在细胞内的分布与细胞的功能密切相关，代谢率高、功能活跃的细胞含线粒体的数量较多，而线粒体嵴的长短密疏与细胞代谢活性有关，如心肌、肾小管上皮细胞线粒体多而大，嵴长而丰富。许多研究已表明：心肌细胞损害是DM心肌病的病理基础\[14\]。
中医药在防治DM血管病变上具有西药无可比拟的优越性，中医学认为DM血管并发症主要病机是气阴两虚并有燥热、痰浊瘀血痹阻脉络，因此益气养阴、清热活血是防治DM血管病变的重要治则。
逐瘀化消饮方中山药益气养阴，善补脾阴，生地滋阴清热、凉血润燥入肾经，脾肾双补共为君药，知母滋阴降火，黄芪大补肺气，以益肾水之源，花粉清肺润燥，共为臣药，况花粉与生地药对合用可降尿糖，与知母合用乃药对之首，其降糖作用起效快，作用强，持续时间长\[15\]。丹皮丹参活血清热，与丹皮、黄连等为佐使之药。, http://www.100md.com(戴红)
清洁级纯种Wistar大鼠，体重180～220g，雌雄各半，共90只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。
1.3 仪器
华中科技大学同济医学院千屏影像工程公司HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统：IBM兼容机、中科院自动化研究所CAA-P530图像分析卡、HV-720型日立摄像机、SONY监视器、HB-Ⅱ型OLYMPUS普通光学显微镜HITACHI。
1.4 实验方法
1.4.1 模型制作及给药方法 随机选取12只大鼠作为正常对照组，测空腹血糖平均值为4.13mmol/L，其余78只禁食12h后，按50mg/kg体重一次性尾静脉注射STZ，72h后测定大鼠空腹血糖>16.65mmol/L且<33.3mmol/L者视为造模成功\[3\]，共76只，其余2只淘汰。将DM大鼠按血糖值高低随机分为5组：模型组、胰岛素组、胰岛素+逐瘀化消饮低剂量组(简称逐瘀化消饮L组)、胰岛素+逐瘀化消饮中剂量组(简称逐瘀化消饮M组)、胰岛素+逐瘀化消饮高剂量组(简称逐瘀化消饮H组)。每组15只(模型组16只)，加上正常对照组12只，共88只。正常组、模型组灌服生理盐水4mL，胰岛素组皮下注射长效胰岛素1～2u，逐瘀化消饮L、M、H组皮下注射长效胰岛素1～2u+灌服逐瘀化消饮0.75g/mL、1.5g/mL、2.0g/mL各4mL。上述六组均每日灌胃1次，治疗周期8周。实验结束时模型组、胰岛素组、逐瘀化消饮L组、逐瘀化消饮M组、逐瘀化消饮H组死亡动物只数分别为8、4、2、2、3只。
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1.4.2 标本采集、取材及检测 治疗第3周末、第6周末及实验结束时禁食、不禁水12h称体重，剪尾尖取血用One TouchⅡ血糖仪测定空腹血糖。
治疗8周后，禁食不禁水12h，断头处死动物，取心脏约0.5mm3～1mm3大小的组织块入10 %中性福尔马林溶液固定。
正常组、模型组、胰岛素组、逐瘀化消饮低剂量组随机选3只动物断头处死，立即取心脏。在房室瓣环水平下约2mm处，切取约1mm×1mm×1mm厚之左右两心室相连的横截面心肌组织3块，入2.5%戊二醛的有盖安瓿瓶中固定。
(1)电镜标本制备：上述心肌组织入2.5%戊二醛中预固定1～2h，1%四氧化锇后固定2h，梯度乙醇脱水，包埋剂渗透包埋，超薄切片机切成厚50～80μm超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅等重金属电子双重染色后，置于H-600透射电镜下观察，摄像。
, 百拇医药 (2)VEGF切片制备及观察：10%中性福尔马林固定组织块6h后，常规石蜡包埋，切片厚4μm。
常规免疫组化染色后在普通光学显微镜下观察，摄像，染色结果判定标准：以细胞胞浆中染色呈棕黄色颗粒为阳性表达，不着色为阴性。VEGF定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，每张切片在高倍镜下(×400)随机选取10个视野，在同一条件下测定视野内心肌组织中VEGF含量，结果以平均光密度值(A)表示，并摄像。
1.5 统计分析
实验数据用±s表示，采用计算机统计软件SPSS 110进行统计分析。
2 结 果
2.1 各组大鼠空腹血糖(FBG)的比较
治疗3、6、8周各治疗组FBG明显下降，无显著性差异。治疗期间各治疗组血糖值自身比较无显著性差异。治疗前后比较，各治疗组均有显著性差异(P<0.01)。见表1。
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注：与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01；与胰岛素组相比，●P<0.05，●●P<001。
经HPIAS-1000图像分析，与正常组相比，心肌组织中VEGF表达模型组平均光密度值有非常显著性差异(P<001)，胰岛素组有显著性差异(P<0.05)，逐瘀化消饮各组无统计学意义。与模型组相比，各治疗组心肌组织中VEGF平均光密度值均低，胰岛素组有显著性差异(P<0.05)，逐瘀化消饮低、中、高剂量组均有非常显著性差异(P<0.01)。与胰岛素组相比，逐瘀化消饮低、中、高剂量组心肌组织中VEGF平均光密度值低，在低、中剂量组有非常显著性差异(P<0.01)，高剂量组有显著性差异(P<005)。
2.3 电镜观察大鼠心肌超微结构
电镜下可见模型组心肌纤维明暗带不清晰，部分肌节明带增宽， PAS阳性物质沉着；线粒体外形不规则，或增大有空泡样变并可见髓鞘样小体，或线粒体缩小，部分线粒体基质密度增加；横切、纵切面大量胶原纤维增生。胰岛素组：心肌纤维明暗带可见，部分线粒体膜不完整，融合，嵴模糊；可见明显胶原纤维增生；心肌细胞核膜完整，染色质分布尚均匀，线粒体形态均匀，部分线粒体嵴模糊不清，肌节明暗带可辨；逐瘀化消饮低剂量组心肌纤维明暗带尚清晰，部分肌纤维明带略有增宽，线粒体膜完整，形态规则，嵴丰富而长；有胶原纤维增生。心肌细胞核间隙增宽，染色质分布不均匀，边集，线粒体膜完整，嵴方向不规则；肌节明带稍增宽，可见局部肌丝断裂。
, 百拇医药
3 讨 论
VEGF也称为血管通透因子，是从牛脑垂体滤泡星状细胞和条件培养基中纯化出来，具有肝素结合活性的、分子量为34~46ku的二聚体糖蛋白\[4\]。它是一种特异性的作用于血管内皮细胞的多功能因子，可以促进内皮细胞增殖、分裂，诱导新生血管形成\[5\]。
VEGF参与体内多种疾病的病理生理过程，一系列生长因子、细胞因子、激素，如转化生长因子、血小板源性生长因子、纤维母细胞生长因子、内皮生长因子、前列腺素E及缺氧都可增加VEGF的转录。VEGF不仅作用于内皮细胞，而且对血管平滑肌细胞、心肌细胞等都有一定的效应\[6\]。
VEGF本身对局部血流动力学并无影响\[7\]，但可促进内皮细胞前列环素、一氧化氮、内皮素-1和Von Willebrand 因子的产生\[8\]，从而增强血管的通透性。VEGF可刺激内皮细胞增殖及分化，增加血管通透性，参与生理及病理的血管发生，调节依赖于内皮组织的血管舒张，而且作为内皮细胞存活因子，可诱导内皮细胞产生抗细胞凋亡蛋白\[9\]。
, 百拇医药
以往国内外人体和动物实验已证实\[10\]：DM可导致心脏重量增加，心肌细胞肥大，肌纤维断裂，肌丝扭曲，线粒体增多，变性肿胀，基质空泡变性呈水样变，细胞内糖原颗粒沉积。近年来不断增多的有关DM心肌病变的实验研究\[11-14\]，表明了心肌细胞超微结构的改变存在于DM早期，是DM心肌病的病理基础。
线粒体的数量、在细胞内的分布与细胞的功能密切相关，代谢率高、功能活跃的细胞含线粒体的数量较多，而线粒体嵴的长短密疏与细胞代谢活性有关，如心肌、肾小管上皮细胞线粒体多而大，嵴长而丰富。许多研究已表明：心肌细胞损害是DM心肌病的病理基础\[14\]。
中医药在防治DM血管病变上具有西药无可比拟的优越性，中医学认为DM血管并发症主要病机是气阴两虚并有燥热、痰浊瘀血痹阻脉络，因此益气养阴、清热活血是防治DM血管病变的重要治则。
逐瘀化消饮方中山药益气养阴，善补脾阴，生地滋阴清热、凉血润燥入肾经，脾肾双补共为君药，知母滋阴降火，黄芪大补肺气，以益肾水之源，花粉清肺润燥，共为臣药，况花粉与生地药对合用可降尿糖，与知母合用乃药对之首，其降糖作用起效快，作用强，持续时间长\[15\]。丹皮丹参活血清热，与丹皮、黄连等为佐使之药。, http://www.100md.com(戴红)