药物血清内黄芪甲苷含量测定及其抑制HSCs活化增殖的实验研究(3)
2.2.1 黄芪甲苷标准品线性关系曲线 黄芪甲苷含量在1～16.6μg范围内呈现良好线性关系。黄芪甲苷保留时间在20.37～22.30min之间。峰面积Y(min.mv)与黄芪甲苷进样量(μg)间回归方程为：Y=0.075×104X-456.76,r=0.9991 (n=13)。
2.2.2 精密度试验 黄芪甲苷对照品溶液重复进样6次，黄芪甲苷峰面积间RSD=1.65%(n=6)，表明黄芪甲苷色谱条件精密度良好。
2.2.3 稳定性试验 黄芪甲苷标准品溶液避光保存条件下，前7天峰面积基本不变，黄芪甲苷峰面积RSD=3.27%(n=6)。表明黄芪甲苷标准品溶液在7天内可保持稳定。
2.2.4 加样回收率试验 黄芪生药回收率为(108.41±131)%，RSD=1.21%(n=6)。黄芪药物血清回收率为：正常药物血清(102.33±2.50)%，RSD=2.44%；病理药物血清(103.66±3.92)%，RSD=3.78%(n=6)。黄芪甲苷加样回收率良好。
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2.2.5 样品测定结果及重复性实验 黄芪生药、正常、病理药物血清内黄芪甲苷含量测定结果(n=6)：黄芪生药提取物中黄芪甲苷含量(n=6)为0.3144μg·μL-1，6次重复实验结果间RSD为2.06%。黄芪药物血清中黄芪甲苷含量(n=6)：正常药物血清0.0851μg·μL-1，RSD=2.11%。病理药物血清0.1140μg·μL-1，RSD=2.61%。测定结果重复性良好。见图3。
A：黄芪甲苷标准曲线(2号峰：黄芪甲苷)；B：黄芪生药提取物(2号峰：黄芪甲苷)；C：黄芪甲苷药物血清(3号峰：黄芪甲苷)
图3HPLC检测黄芪甲苷色谱图2.3 黄芪甲苷对HSCs活化增殖影响
2.3.1 黄芪甲苷对HSCs增殖影响 与对照组相比，黄芪甲苷可明显抑制HSCs增殖(P<0.05)。见表1。
2.3.2 黄芪甲苷对HSCs I型胶原分泌影响 与对照组相比，黄芪甲苷虽可抑制HSCsⅠ型胶原分泌，但与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。见表2。
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目前我国乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)携带者超过1亿，占我国人口的十分之一。全球丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)携带者也近2亿人。部分乙型、丙型肝炎患者会发展至慢性肝病。加之其它病因导致的慢性肝病，如慢性酒精性肝病、中毒性肝病等，慢性肝病患者数量巨大。同时，在我国肝癌患者中，95%可找到乙肝证据。慢性肝炎、肝硬化、肝癌成为恶性发展链。减缓或阻止肝纤维化进程成为重要的抗肝硬化、肝癌治疗对策\[9\]。肝纤维化是肝脏内细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)弥漫性过度沉积性疾病，但无假小叶的形成。HSCs增殖、胶原合成增加是肝纤维化形成的重要环节之一\[10 \]。HSCs活化增殖，与肝纤维化的关系极为密切\[11\]。抑制HSCs的活化增殖及胶原合成，对于肝纤维化防治具有重要意义。
中医药治疗肝纤维化近年来成为研究重点。精简组方、对单味药进行深入研究是中药研究方向。中医认为慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化属于血瘀气结、脾虚范畴\[12\]。黄芪是中药补益补气的重要用药。目前研究表明，黄芪在防止肝糖原减少、抑制肝细胞脂质过氧化、拮抗肝脏内毒素、保护肝脏线粒体损伤、防止肝纤维化等方面均发挥重要作用\[13\]。
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本研究表明，黄芪甲苷可抑制HSCs增殖，可能为黄芪抗肝纤维化的有效作用成分之一。但黄芪甲苷对HSCs的 I型胶原分泌并无显著抑制作用，表明其抑制肝纤维化作用的主要途径可能是抑制、减少活化的HSCs数量，而HSCs一旦活化为功能亢进细胞，黄芪甲苷可能不能进一步抑制胶原的合成分泌。故而作者考虑，黄芪抗肝纤维化作用可能通过减少HSCs数量或促进肝脏中胶原降解实现，而非直接抑制胶原合成。其更明确的作用机制仍需针对肝纤维化发生中多种因素进行研究。
本研究结果提示，黄芪正常、病理药物血清内黄芪甲苷含量存在差异，表明不同机体状态(健康、肝纤维化)对于不同药物的代谢过程及产物影响不同，符合中医辨证施治原则。部分中药经正常、病理不同机体代谢后代谢产物可能有所不同。故在选择中药研究方法时，应当从药物预期应用的人群进行考虑，若是用于养生的预防保健性药物，其前期研究更应注重在正常机体内的作用效果及不良反应。若明确用于某种疾病治疗的药物，对其机制与疗效的研究宜选择在同种病理模型动物体内进行更为妥当。
, 百拇医药
参考文献
\[1\] 姚希贤，唐有为，姚冬梅，等.益肝煎剂对实验性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响 \[J\].世界华人消化杂志，2001, 9 (3): 263-267.
\[2\] Li C, Ren H, Zhang X, et al. Influence of leaf-picking on effective constituents of the Astragalus mongholicus roots \[J\]. Zhong Yao Cai, 1997, 20(12):494-496.
\[3\] 张声鹏，施旭光，桂蜀华.关于中药血清药理学中血清供体动物是否造模的思考 \[J\].中国中西医结合杂志, 2001, 21(5): 388-389.
\[4\] Mazzocca A, Sciammetta SC, Carloni V, et al. Binding of hepatic C virus envelope protein E2 to CD81 up-regulates matrix metalloproteinase-2 in human hepatic stellate cells \[J\]. J Biol Chem, 2005, 280(12): 11329-11339.
, 百拇医药
\[5\] Wu J, Zern MA. Hepatic stellate cells: a target for the treatmeat of liver fibrosis\[J\]. J Gastroenterol, 2000, 35(9): 665-672.
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\[7\] Zhu Y, Liu T, Song K, et al. Asipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC \[J\]. Cell Biochem Funct, 2008, 7：17.
, http://www.100md.com
\[8\] Han M, Wen JK, Zhou XX. Effect of yiqi huoxue huayu recipe on vascular collagen turnover and relevant gene expression \[J\]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 2004, 24(2):136-139.
\[9\] 姚光弼. 肝脏损伤的机制 \[J\].中华消化杂志, 1998, 18(1): 235-236.
\[10\] Elsharkawy AM, Oakley F, Mann DA. The role and regulation of hepatic stellate cell apoptosis in reversal of liver fibrosis \[J\]. Apoptosis, 2005,10(5):927-939.
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\[11\] Gong W, Pecci A, Roth S, et al. Transformation-dependent susceptibility of rat hepatic stellate cells to apoptosis induced by soluble Fas ligand \[J\]. Hepatology, 1998, 28(2): 492-502.
\[12\] 曾民德.中西医结合抗纤维化.肝纤维化的治疗及其疗效评估 \[J\].中国中西医结合杂志, 2002, 22(5): 329.
\[13\] 潘年松，张立实，徐正莉.肝纤维化的中医药研究 \[J\].世界华人消化杂志，2003，12(32):127-130., http://www.100md.com(吕涛 姚希贤 孙泽明)
2.2.2 精密度试验 黄芪甲苷对照品溶液重复进样6次，黄芪甲苷峰面积间RSD=1.65%(n=6)，表明黄芪甲苷色谱条件精密度良好。
2.2.3 稳定性试验 黄芪甲苷标准品溶液避光保存条件下，前7天峰面积基本不变，黄芪甲苷峰面积RSD=3.27%(n=6)。表明黄芪甲苷标准品溶液在7天内可保持稳定。
2.2.4 加样回收率试验 黄芪生药回收率为(108.41±131)%，RSD=1.21%(n=6)。黄芪药物血清回收率为：正常药物血清(102.33±2.50)%，RSD=2.44%；病理药物血清(103.66±3.92)%，RSD=3.78%(n=6)。黄芪甲苷加样回收率良好。
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2.2.5 样品测定结果及重复性实验 黄芪生药、正常、病理药物血清内黄芪甲苷含量测定结果(n=6)：黄芪生药提取物中黄芪甲苷含量(n=6)为0.3144μg·μL-1，6次重复实验结果间RSD为2.06%。黄芪药物血清中黄芪甲苷含量(n=6)：正常药物血清0.0851μg·μL-1，RSD=2.11%。病理药物血清0.1140μg·μL-1，RSD=2.61%。测定结果重复性良好。见图3。
A：黄芪甲苷标准曲线(2号峰：黄芪甲苷)；B：黄芪生药提取物(2号峰：黄芪甲苷)；C：黄芪甲苷药物血清(3号峰：黄芪甲苷)
图3HPLC检测黄芪甲苷色谱图2.3 黄芪甲苷对HSCs活化增殖影响
2.3.1 黄芪甲苷对HSCs增殖影响 与对照组相比，黄芪甲苷可明显抑制HSCs增殖(P<0.05)。见表1。
2.3.2 黄芪甲苷对HSCs I型胶原分泌影响 与对照组相比，黄芪甲苷虽可抑制HSCsⅠ型胶原分泌，但与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。见表2。
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目前我国乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)携带者超过1亿，占我国人口的十分之一。全球丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)携带者也近2亿人。部分乙型、丙型肝炎患者会发展至慢性肝病。加之其它病因导致的慢性肝病，如慢性酒精性肝病、中毒性肝病等，慢性肝病患者数量巨大。同时，在我国肝癌患者中，95%可找到乙肝证据。慢性肝炎、肝硬化、肝癌成为恶性发展链。减缓或阻止肝纤维化进程成为重要的抗肝硬化、肝癌治疗对策\[9\]。肝纤维化是肝脏内细胞外基质(extra cellular matrix, ECM)弥漫性过度沉积性疾病，但无假小叶的形成。HSCs增殖、胶原合成增加是肝纤维化形成的重要环节之一\[10 \]。HSCs活化增殖，与肝纤维化的关系极为密切\[11\]。抑制HSCs的活化增殖及胶原合成，对于肝纤维化防治具有重要意义。
中医药治疗肝纤维化近年来成为研究重点。精简组方、对单味药进行深入研究是中药研究方向。中医认为慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化属于血瘀气结、脾虚范畴\[12\]。黄芪是中药补益补气的重要用药。目前研究表明，黄芪在防止肝糖原减少、抑制肝细胞脂质过氧化、拮抗肝脏内毒素、保护肝脏线粒体损伤、防止肝纤维化等方面均发挥重要作用\[13\]。
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本研究表明，黄芪甲苷可抑制HSCs增殖，可能为黄芪抗肝纤维化的有效作用成分之一。但黄芪甲苷对HSCs的 I型胶原分泌并无显著抑制作用，表明其抑制肝纤维化作用的主要途径可能是抑制、减少活化的HSCs数量，而HSCs一旦活化为功能亢进细胞，黄芪甲苷可能不能进一步抑制胶原的合成分泌。故而作者考虑，黄芪抗肝纤维化作用可能通过减少HSCs数量或促进肝脏中胶原降解实现，而非直接抑制胶原合成。其更明确的作用机制仍需针对肝纤维化发生中多种因素进行研究。
本研究结果提示，黄芪正常、病理药物血清内黄芪甲苷含量存在差异，表明不同机体状态(健康、肝纤维化)对于不同药物的代谢过程及产物影响不同，符合中医辨证施治原则。部分中药经正常、病理不同机体代谢后代谢产物可能有所不同。故在选择中药研究方法时，应当从药物预期应用的人群进行考虑，若是用于养生的预防保健性药物，其前期研究更应注重在正常机体内的作用效果及不良反应。若明确用于某种疾病治疗的药物，对其机制与疗效的研究宜选择在同种病理模型动物体内进行更为妥当。
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