美沙拉嗪干预溃疡性结肠炎相关癌变小鼠的实验研究(2)
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参见附件。
1.3 实验药物
美沙拉嗪(商品名：惠迪，国药准字H19980148)，葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司生产。
2 方 法
2.1 模型制备及分组处理
参照文献报道[4]所有雄性5周龄BALB/c小鼠60只，在恒温(23℃±2℃)、恒湿(50%±10%)、昼夜循环(12h∶12h)条件下适应性喂养1周，按体重随机分为模型组、治疗组(低、中、高剂量组)、正常组，每组12只。将DMH溶于生理盐水中，使其终浓度为20mg/kg(0.4% DMH 0.05mL/100g)，用1 M NaOH调整pH值至6.5。除正常组外，其余各组腹腔注射DMH 20mg/kg，每周2次；继而在小鼠饮用水中添加3%DSS(浓度为30g/L),连续自由饮用2周，以上述过程为1个循环；共重复3个循环，模型组予等剂量生理盐水灌胃20周，治疗组分别按成人用药量的3，6，12倍给药，即0.2g/kg，0.4g/kg，0.8g/kg(按实验动物与人按体表面积比等效剂量换算比率，将每天剂量折算成小鼠等效剂量作为中剂量组用量：小鼠用量＝人每日口服药量×0.0026/0.02kg=4g*0.0026/0.02kg=0.4g/kg),小鼠灌胃给药体积为0.4mL/10g[5]，观察各组小鼠毛发、体重、耗食、大便、耗水及死亡等变化。
2.2 标本采集
全部小鼠第9周末脱椎处死，迅速剖取全部结肠(从回盲瓣至肛门)，选择性取材(挑取溃疡或肿瘤最明显处病变肠段)沿纵轴切开，分为2部分，首先将第1部分，用生理盐水迅速冲净后，置于标本体积10倍以上的10%中性福尔马林溶液中固定，剩余部分置于液氮保存，备测。
2.3 指标检测
2.3.1 小鼠结肠病理改变情况的观察 将已用10%中性甲醛固定好的小鼠结肠取出，然后切取病变处，经用流水冲洗，放入生物脱水机进行逐级脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋切片4μm，常规HE染色，封片，光镜下观察结肠黏膜组织形态学变化情况。
2.3.2 小鼠结肠损伤评分 将结肠向上平铺于白色硬纸板(预冷的冰盒)上，大头针固定后，用放大镜观察黏膜的急性损伤程度、炎症、溃疡、肿瘤发生(异常隐窝灶)等变化并予评分。评分标准见表1[6]。
2.3.3 小鼠结肠病理改变情况的观察 将已用10%中性甲醛固定好的小鼠结肠取出，然后切取病变处，经用流水冲洗，放入生物脱水机进行逐级脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋切片4μM，常规HE染色，封片，光镜下观察炎症和溃疡情况。组织学损伤评分标准见表2[7]。
2.3.4 不典型增生评价标准 不典型增生按照Morson等描述的标准分低度和高度不典型增生[8]；癌分为原位癌和进展期癌；前者定义为癌细胞浸润至黏膜层或黏膜下层；后者定义为癌细胞浸润至肌层及以外。
2.4 统计学分析
实验数据以均数±标准差(±s)表示，用SPSS 11.5 for Windows软件进行数据处理与分析。Oneway Analysis of Variance(One-way ANOVA)进行各组间方差分析，方差齐同时用LSD法，方差不齐时用Tambane’S T2法，P<0.05为有统计学意义。检验水准为α=0.05。
3 结 果
3.1 肉眼观察结肠黏膜损伤情况
肉眼可见正常组结肠黏膜光滑，未见充血、水肿、糜烂及溃疡变化；模型组结肠黏膜充血水肿明显，浆膜层可见多处息肉状隆起样改变，异常隐窝灶；低剂量组肉眼见结肠黏膜充血水肿，部分可见溃疡样改变，；中、高剂量组肉眼见结肠黏膜充血、水肿，糜烂。经统计学比较，美沙拉嗪具有明确防治溃结相关癌变效应，各剂量组比较无明显差异(表1)。
3.2 小鼠结肠黏膜光镜下病理变化
镜下见正常组：结肠黏膜未见明显异常；模型组：黏膜上皮脱落甚至溃疡形成，黏膜息肉样隆起，固有腺体萎缩，可见高级别上皮内瘤变、部分可见癌变；低剂量组：黏膜上皮脱落，糜烂重，大量中性粒细胞浸润，固有腺体部分萎缩；中剂量组：黏膜上皮脱落，充血、水肿，淋巴细胞浸润明显，未见溃疡形成及固有腺体萎缩；高剂量组：黏膜上皮脱落，充血、水肿，未见明显溃疡。经统计学分析，美沙拉嗪具有明确防治溃结相关癌变效应，各剂量组比较无明显差异(插页Ⅰ图1、表3)。
4 讨 论
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是基于基因易患基础上，综合环境、免疫异常等多因素所致肠道非特异性炎症，属于炎症性肠病的一种。UC病因未明，目前UC的治疗主要以缓解症状为主，尚无法得到根治[9]。UC在欧美国家发病率为(79～268)/105[10]，中国发病率为11.6/105[11]。据报道，UC患者结肠组织上皮异性增生(高级别或低级别)发生在进展期大肠癌之前，内镜检查可见单发或多发腺瘤样假性息肉改变，这些病理改变被看作是癌前状态[12]。UC患者结肠癌变的危险性增加，尤其是当病程长、病变累及全结肠的UC患者伴有严重的不典型增生时[13-14]；一项荟萃分析指出UC癌变的几率与病程密切相关，罹患UC 10年、20年、30年的患者，其癌变发生率分别为2%、8%、18%[3]。
课题组前期文献调研发现，对那些有较高风险的UC人群进行化学预防即在目标人群中使用天然、合成或生化的药物进行干预治疗，可以达到逆转癌前病变、降低肿瘤发病率和死亡率的目的[15]。本项目研究结果提示，美沙拉嗪具有明确防治溃结癌变的生物学效应，各剂量组之间比较无明显差异，由此推测，UC患者长期服用维持剂量美沙拉嗪对于预防溃结相关癌变是有力的。
美沙拉嗪作为反应性氧自由基清除剂,其主要成分为5-氨基水杨酸，具有非甾体类抗炎效果，可通过减少NF-κB活化,阻断炎症因子如前列腺素、白介素的产生，降低炎症反应；同时该药可能通过结合PPARγ，促进PTEN表达，阻断上皮细胞PI3K信号通路，发挥化学预防UCAC的效应[16-17]。但是，关于美沙拉嗪预防UCAC的临床证据尚需通过严格的随机对照双盲设计 ......
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