LC-MS/MS法快速筛选保健食品中非法添加的18种止咳平喘化学成分(2)
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参见附件。
2.4样品溶液的配制
取供试品适量(约相当于一次用量)，研细，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声15min，溶解，放冷置室温，加甲醇稀释至刻度，滤过(0.45μm滤膜)，取续滤液，即得。
2.5测定
取样品溶液和混合对照品溶液各2μL注入液质联用仪，按照LC-MS/MS测定条件分别进行分析。3 结果与讨论
3.1质谱条件的优化
分别将18种对照品储备溶液(约100μg/ml)用甲醇稀释成1μg/ml的对照溶液，选用ESI离子化模式，通过直接进样法，进行质谱条件优化。首先，采用一级质谱的扫描方式可得到准分子离子峰，在确定准分子离子的基础上，进行毛细管电压的优化，得到各化学成分的最佳毛细管电压(DP)，再用MS/MS breakdown的方式仪器自动产生各子离子及其相应的最佳碰撞能量(CE)，以最高丰度的子离子作为检测离子。多反应监测(MRM)扫描方式即采用多通道对各化学成分的检测离子在其最佳毛细管电压和碰撞能量的条件下同时进行扫描。在实际样品测定中为防止出现一些干扰，可增加多个离子对进行筛选。各化学成分优化结果见表1。
3.2 检测限
取对照品溶液适量，加甲醇逐步稀释，按上述液质联用条件进行测定，以S/N=3，计算各化学成分的检测限。
上述化学成分在MRM方式下的LOD取决于其本身的原因外，主要与离子化的效率有关。18种化合物的检测限除福尔可定为2ng外，其他成分均小于1ng，其结果见表2。
根据上述各种化学成分检测限的浓度，分别在不同剂型，如：胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液、散剂、润喉糖等剂型的空白样品中，加入适量对照品，按样品溶液的配制方法同法处理，制成相当于检测限浓度的样品溶液，在相同的液质联用条件下，S/N仍能达到3，即基质对检测结果无干扰。
3.3样品测定结果
进行样品筛选分析后，如供试品色谱图中检出的某离子色谱峰的保留时间与混合对照品溶液中某化学成分相应离子色谱峰保留时间相一致，则取该化学成分的准分子离子进行二级质谱全扫描验证，若供试品的保留时间和特征碎片离子均与对照品相同，则判断该供试品中含有此化学成分。
混合对照品色谱图见图1。由图1可见有多个组分虽然在保留时间上看似不能达到完全分离，但由于MRM方式特征母离子/子离子对具特有的专一选择性，不会造成相互间的干扰，18种化学成分均能得到较好检测。
样品的色谱图见图2。由图2可见，保留时间7.376 min、3.141min 处出现两个色谱峰，相应的离子对分别为317.3/86 .0、178.9/164.0 ，与混合对照品色谱图中盐酸二氧丙嗪、茶碱对照品保留时间及相应离子对一致，由此可初步筛选出样品中可疑止咳平喘化学成分的存在，再取其母离子进行二级质谱全扫描，其特征碎片与对照品也一致，由此判断样品中含盐酸二氧丙嗪和茶碱成分。样品的验证质谱图见图3。
4讨 论
(1)本实验筛选时采用的梯度流动相，验证时采用了等度流动相，这样既节省了时间又使保留时间再次得到验证。对于混合对照中基本无保留的成分福尔可定，验证时可将流动相中0.1%甲酸溶液改成10mmol/L醋酸铵水溶液，即能得到良好保留。
(2)如样品分析过程中选择的离子对出现与对照品保留时间相同或者接近的色谱峰，还可以增设更多的离子对同时进行分析，增加实验的专属性。
(3)本实验共建立了同时筛选保健品食品中可能非法添加的18种止咳平喘类成分的方法，该方法采用多反应监测的方式检测，干扰少，灵敏度高，检测结果更准确。
参考文献
[1] 董永成，杜士明，陈永顺，等.中成药及保健品非法添加化学成分的类型、危害及对策[J].时珍国医国药，2006,8(17)：1601-1602.
[2]李莉，张刚平，李晓敏，等.平喘镇咳类中成药中非法添加4种化学药品检验方法的研究[J].中国药房 2008,9(19),676-678 ......
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