丹苘软胶囊对非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏SOCS-3mRNA表达的影响(2)
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参见附件。
2.4.3 RNA的鉴定 (1)RNA纯度鉴定:取5μL RNA溶液，加DEPC水稀释至60μL，枪头混匀，以DEPC水作为空白对照，读取紫外分光光度计260nm、280nm波长下的光密度值，计算其A260/A280的比值，纯RNA样本的A260/A280的比值为1.8~2.0。如低于1.8，则表明存在蛋白质污染;如大于2.0，则表明有异硫氰胍等污染。(2)RNA浓度测定:取5μL RNA溶液，加DEPC水稀释至60μL，枪头混匀，以DEPC水作为空白对照，读取紫外分光光度计260nm波长下的光密度值。按下面公式计算RNA浓度:RNA(μg/μL)=A260nm光密度值*40*60/5/1000。(3)RNA完整性鉴定:应用1%甲醛变性的琼脂糖电泳鉴定RNA完整性。用1*MOPS(MOP4.18g/mL，NaAc4.98mmol/L，EDTAlmmol/L，Phs.0)配制1%琼脂糖凝胶，加EB终浓度0.5mg/mL,熔化后每30mL凝胶中加入370g/L甲醛(终浓度200g/L)1.65而配制凝胶，取RNA样品2μL加上样缓冲液10μL，95℃变性2min，以1MOPS为电泳缓冲液电泳2～4h，紫外灯下观察，可见28s、185s、55s三条带。通常以285和185的显色强度比为2∶1为无RNA降解，如比值降低，逆转或条带模糊，则表明有RNA降解。
2.4.4 一步法RT-PCR扩增 扩增体系(25μL)见表3。
扩增条件:(1)50℃，30min;94℃预变性2min。(2)变性94℃30sec。，复性58℃30 sec。及延伸72℃ 1min，共进行30个循环。
2.4.5 RT-PCR产物的检测及半定量分析 取6μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，恒压80v，电泳1h，紫外灯下分析PCR结果，并用凝胶成像分析系统测定灰度值，计算SOSC-3/β-actin的比值，以获得目的片段的相对表达量。
2.5 统计学分析
数据以均数±标准差(±s)表示,所有资料进行正态性检验；多组计量资料采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐时采用LSD和SNK法，方差不齐时采用Tamhane’sT2或Dunnett’sT3法，所有数据均用SPSS 16.0统计软件包进行处理。
3 结果与分析
各组中SOSC-3 mRNA均普遍表达。空白组、中药各剂量组及西药组SOSC-3 mRNA表达水平较模型组低，其差异具显著性(P<0.01)；中药高、中剂量组、西药组之间SOSC-3 mRNA表达水平无显著差异；中药低剂量组SOSC-3 mRNA表达水平高于中药高剂量组，其差异具有显著性(P<0.01)。详见图1，表4。
4 讨 论
近年来研究发现，NAFLD常伴有胰岛素抵抗(IR)和高胰岛素血症，并与机体对瘦素的敏感性降低有关[7]。SOCS-3具有抑制JAK-STAT信号转导通路的作用，而且JAK-STAT信号转导的瀑布级联效应是瘦素、胰岛素、IL-6、TNF-α等多种细胞因子的胞内信号转导通路[8-10]。胰岛素、瘦素均可诱导SOCS-3产生，并进而抑制胰岛素、瘦素信号转导。此外，SOCS-3也参与了其他细胞因子(如IL-6、抵抗素[11])诱导的IR的发生。因此SOCS-3被认为是参与IR及瘦素抵抗的重要抑制因子。
中医学认为NAFLD病因与嗜食肥甘厚味，多逸少劳有关，其病位在肝，与脾、肾等脏腑密切相关，由脾肾肝三脏功能失调，痰瘀互结、湿热内蕴，停积于肝所致。丹苘软胶囊针对痰瘀互结、湿热内蕴这一主要病机，并结合现代药理研究成果，精选丹参、苘麻子二味中药，提取其有效作用部位物质加工而成。具有活血化瘀、清热利湿之功效，切合非酒精性脂肪肝的中医发病病机。经气相色谱质谱联用仪检测后，丹苘软胶囊中苘麻子油总不饱和脂肪酸相对含量约占脂肪酸总量的73.18%，其中亚油酸含量为60.73%。丹参石油醚浸膏中主要成分为：丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ，其中丹参酮ⅡA约为0.2%。亚油酸属于多不饱和脂肪酸(Polyunsturated fatty acids,PUFA)的一种，是公认的必需脂肪酸，具有降低血液胆固醇，预防动脉粥样硬化的作用。丹参酮ⅡA具有天然抗氧化作用，在抗肿瘤、心脑血管疾病、抗菌消炎等方面均有良好的治疗作用。
在前期进行的研究中我们发现丹苘软胶囊可以通过改善NAFLD模型大鼠IR及瘦素抵抗，从而达到改善NAFLD的作用。通过相关文献整理研究，在本次研究中，我们选取大鼠肝脏SOCS-3这一关键因子作为观察指标，以了解该丹苘软胶囊改善大鼠IR及瘦素抵抗作用的可能机制。结果发现丹苘软胶囊能显著降低NAFLD模型大鼠肝脏SOCS-3mRNA表达，据此我们推测对大鼠SOCS-3mRNA表达的下调，可能是丹苘软胶囊改善NAFLD模型大鼠IR及瘦素抵抗的重要机制。
参考文献
[1] 陈席，范建高.非酒精性脂肪肝:代谢综合征的另一个特征[J].实用肝脏病杂志，2004，7(1):19-21.
[2] Alba LM,Lindor K,Rewview article:Nonalcoholic fatty liver disease[J].Aliment Pharmacol Ther,2003,17(8):977-986.
[3] 范建高，曾民德.非酒精性脂肪性肝病的分类及其诊断策略[J].中华肝脏病杂志，2003,11(2)：127-128.
[4] Farrell GC，Chitturi S，Lau GK，et al.Guidelines for the assessment and management of non-alcoholic fatty liver disease in the Asia-Pacific region：executive summary[J] ......
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