表没食子儿茶素没食子酸酯对Hela细胞的诱导凋亡作用及靶点蛋白质研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
2.3Annexin V/PI标记法检测凋亡
将2.1中细胞吸出培养液，预冷PBS洗涤弃上清，残渣细胞收集至流式管。每管加10μL Annexin V和5μL PI，避光静置15min，加300μL预冷的PBS，振荡混匀上机。
2.4倒置显微镜下观察细胞凋亡形态
取2.3中细胞沉淀涂片，在荧光显微镜下观察各实验组的细胞形态。
2.5微球吸附法检测EGCG靶点蛋白
2.5.1微球制备取10mL的微球装入砂滤漏斗，用100mL蒸馏水洗3次，然后用50mL 1mol/L Na2CO3缓冲液(pH 11.0)清洗2遍。加10mL 1mol/L Na2CO3缓冲液(pH 11.0)，将微球转移至250mL烧杯。取1g溴化腈，用1mL乙腈溶解，加至上步的微球中，室温反应10min。将微球转移至砂滤漏斗，10倍柱体积的1× PBS洗涤，转移至50mL离心管。
2.5.2EGCG偶联到固相介质EGCG配成5g/L，加至上步的离心管中，冰上反应3h，转移至砂滤漏斗，1× PBS洗涤10次，转移至50mL离心管，4℃保存备用。
2.5.3Hela细胞裂解液制备Hela细胞用预冷(4℃)的1× PBS清洗2次，加细胞裂解液10mL(RIPA和PMSF比例为100∶1)，枪头吹打细胞，收集至50mL离心管，4℃放置30min，12000r/min离心10min，吸上清，调整蛋白浓度约为10 g/L。
2.5.4EGCG微球吸附靶蛋白将Hela细胞裂解液与偶联EGCG微球孵育，4℃过夜，再将微球转移至砂滤漏斗，1× PBS洗涤5次，取200μL微球加200μL 2×SDS溶液，94℃煮3min，离心，取上清SDS-PAGE电泳，以未偶联有EGCG的微球与Hela细胞裂解液孵育洗脱后的离心上清液作为阴性对照。
2.5.5SDS-PAGE胶考马斯亮染染色用刀轻轻分开玻璃板，用染色液染色过夜，再用脱色液将背景脱至干净，用ddH2O将凝胶洗2次，每次2min，凝胶成像仪扫描。
2.5.6质谱鉴定切下胶上目标条带，以空胶块作对照。50μL 30 mmol/L K3Fe(CN)6 和100 mmol/L Na2S203以体积比1∶1加入胶块内，脱色2次，再加入100μL 100 mmol/L NH4HCO3，脱水冻干。冻干后，各加入5μL 0.01g/L胰蛋白酶溶液，置于4℃冰箱30～60min，使胶块充分吸胀，加入25μL 50mmol/L NH4HCOs缓冲液，37℃酶解过夜，吸出酶解液，转移至新EP管中，原管加入100μL抽提液(60%乙腈、0.1%三氟乙酸、40%超纯水)，超声15 min，反复抽提3次，合并后冻干。润湿C18介质后，平衡Zip Tip枪头，捆绑肽段或蛋白质，洗去盐分和残留物，点样后进行LTQ ESI质谱检测。采用IPI上人的非冗余蛋白数据库，SE QUEST2过滤参数设置：当Charge+1，x corr≥1.9，当Charge+2，x corr≥2.2，当Charge+1，X corr≥3.75，其中Del CN≥0.1，单向电泳和质谱鉴定由中国科学院生物物理研究所协助完成。
2.6 Hela细胞肌动蛋白聚合体(F-actin)
鬼笔环肽染色 Hela细胞爬片生长24h，与加终浓度50、100、200、400μg/mL梯度组浓度的EGCG溶液各200μL，作用24h和48h，预温PBS(37℃)清洗细胞2次，4%多聚甲醛室温固定7min，PBS清洗细胞3次，5μg/mL鬼笔环肽工作液室温染色50min，PBS清洗3次，吸去多余水分，加荧光封片液封片，荧光显微镜下观察。
2.7统计学分析
固定药物浓度后不同药物作用时间组之间的MTT抑制率、流式凋亡百分比比较采用独立t检验，固定药物作用时间后不同药物浓度组间MTT抑制率、流式凋亡百分比比较均采用单因素方差分析和LSD两两检验(只检验两两之间差异)，以P<0.05为具有显著统计学意义。
3结 果
3.1MTT检测生长抑制率
见图1，终浓度50、100、200、400μg/mL梯度组浓度的EGCG溶液处理Hela细胞24h其生长抑制率分别为22.5%±4.3%、33.4%±5.9%、48.4%±6.1%、58.8%±8.8%，处理48h其生长抑制率分别为37.8%±5.6%、53.9%±7.2%、69.4%±7.1%、73.6%±8.9%。24h作用时间，50和100、100和200μg/mL之间抑制率差异存在显著统计学意义(P<0.05)。48h作用时间，50和100、200和400μg/mL之间抑制率差异存在显著统计学意义(P<0.05，P<0.05)。50μg/mL组24h和48h间抑制率差异具有显著统计学意义(t=-5.30，P<0.01)，100μg/mL组24h和48h间抑制率差异具有显著统计学意义(t=-5.39，P<0.01)，200μg/mL组24h和48h间抑制率差异具有显著统计学意义(t=-5.49，P<0.01)，400μg/mL组24h和48h间抑制率差异具有显著统计学意义(t=-2.90，P<0.05)。
3.2 Annexin V/PI标记法检测凋亡
见表1、图2，固定作用时间组，24h的EGCG的50组、200组、400μg/mL组和前一浓度组相比，差异均具有显著统计学意义(P<0.01)，48h的EGCG的50组、100组、200μg/mL组和前一浓度组相比，差异均具有显著统计学意义(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。50μg/mL组24h和48h间抑制率差异具有显著统计学意义(t=-3.45，P<0.01)，100μg/mL组24h和48h间抑制率差异具有显著统计学意义(t=-6.53，P<0.01)，200μg/mL组24h和48h间抑制率差异具有显著统计学意义(t=-5.43，P<0.01)，400μg/mL组24h和48h间抑制率差异具有显著统计学意义(t=-3.32，P<0.01)。
3.3 显微镜下观察Hela细胞凋亡形态
见插页Ⅴ图3，用药后细胞生长受到抑制，细胞体积缩小变圆 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2429kb)。