5种中药注射剂对多柔比星所致心肌H9c2损伤保护作用(2)
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1.55种中药注射剂对DOX抗肿瘤活性的影响A549肺癌细胞株购自上海生命科学研究院细胞库。A549细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养液，置37 ℃、5% CO2培养箱培养。96孔板每孔加入100μL A549心肌细胞(约5000个/孔)和50μL中药注射剂溶液，混匀后培养24h。加入50μL DOX溶液至终浓度至1.02,0.35,0.12×10-7M，孵育48 h。用结晶紫法检测细胞存活率。
1.6结晶紫法检测细胞存活率细胞培养结束后，去除培养液，每孔中加入200μL 11%的戊二醛固定20min。弃去戊二醛，细胞用去离子水洗涤两次。细胞培养板置37℃烘箱中彻底干燥后，每空加入0.1%的结晶紫液100μL，振摇染色30min。弃去染色液，用去离子水洗涤两次。细胞培养板置37℃烘箱中彻底干燥后，加入10%的乙酸提取细胞吸收的结晶紫。在595 nm测定光吸收度，按如下公式计算存活率：存活率=(A给药孔-A空白孔)/(A对照孔-A空白孔)×100 %[5]。
1.7统计方法各组实验数据以(±s)表示。两组间比较采用t检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。
2结果
2.15种中药注射剂对DOX损伤H9C2细胞存活率的影响由图1可知，不同浓度的DOX与心肌H9c2细胞孵育，可引起H9c2细胞凋亡，并呈现出不同的存活率。单用DOX的IC50为1.8×10-7 M(95%置信区间为0.5×10-7～7.0×10-7M)。联合给予参麦注射剂、丹参注射剂、冠心宁注射剂、黄芪注射剂或香丹注射剂，DOX对H9c2细胞的IC50无明显影响，IC50分别为：1.8×10-7 M(95%置信区间为0.3×10-7～1.1×10-6M)；1.8×10-7 M(95%置信区间为0.3×10-7～1.1×10-6M)；1.8×10-7 M(95%置信区间为0.4×10-7～8.5×10-7M)；1.5×10-7 M(95%置信区间为0.3×10-7～7.6×10-7M)；1.4×10-7 M(95%置信区间为0.2×10-7～9.6×10-7M)。但与DOX组相比，黄芪注射剂和香丹注射剂可以有效地增加低浓度(主要表现为1.06, 0.35和0.12×10-7 M)DOX作用下心肌细胞的存活率。
A.参麦注射剂；B.丹参注射剂；C.冠心宁注射剂；D.黄芪注射剂；E.香丹注射剂
图15种注射剂对DOX作用下H9c2心肌细胞的
存活率的影响(n=4，±s)2.25种中药注射剂对DOX损伤H9c2培养液中MDA和SOD的影响按试剂盒操作规程测定心肌H9c2细胞与DOX以及合用黄芪注射剂或香丹注射剂孵育48h后的MDA水平和SOD。与正常对照组比较，0.35×10-7 M的DOX引起H9c2细胞中MDA含量降低而SOD酶活性显著增高(P<0.05)。提前给予黄芪注射剂或香丹注射剂可以有效地缓解DOX所引起的心肌细胞MDA浓度增高，提高SOD酶活性，详见表1。
表1中药注射剂对多柔比星处理48h后H9c2细胞中
丙二醛(MDA)的影响(n=4，±s)
组别MDA
(nmol/mg protein)SOD
(U/mg protein)对照组10.6±0.656.8±1.8DOX组18.3±2.1*29.8±3.8*HQ+DOX组14.7±0.5*#42.6±2.4*#XD+DOX组13.2±1.4*#39.8±3.1*#注：与对照组比较，*P<0.05；与DOX组比较，#P<0.05。
2.35种中药注射剂对DOX抗肿瘤活性的影响由表2可知，3个浓度的DOX可引起A549肺癌细胞不同程度的凋亡。黄芪和香丹注射剂并不影响DOX的体外抗肿瘤活性。
表2中药注射剂对多柔比星处理48h后A549肺癌细胞
存活率的影响(n=4，±s)
DOX浓度
(×10-7M)细胞存活率(%)DOX组XD+DOX组HQ+DOX组1.0672.3±5.173.9±4.375.8±6.60.3583.2±4.385.1±3.284.9±4.60.1288.7±5.790.1±4.886.5±3.9注：与DOX组比较，*P<0.05。
3讨论
DOX的临床应用被其所致的心脏、肾脏、生殖等多器官、多组织的毒性所限制，其中更是以心脏毒性为甚[1]。大量的研究表明在体内游离的DOX会在在肝脏药物代谢酶的作用下还原成半醌自由基，进而与O2反应，产生氧自由基，造成心肌细胞膜和线粒体膜的氧化损伤[2]。作为心血管疾病用注射剂，参麦注射剂、丹参注射剂、冠心宁注射剂、香丹注射剂和黄芪注射剂等被均证实在体内或体外具有一定的抗氧化活性，可有效清除氧自由基、抑制脂质过氧化、调节多种抗氧化物酶活性。
本研究给予不同质量浓度的丹参注射液、参麦注射液、冠心宁注射液、香丹注射剂和黄芪注射剂后，结果表明，黄芪注射剂和香丹注射剂可以有效地增加DOX作用下心肌H9c2细胞的存活率，缓解DOX所引起的心肌细胞MDA浓度增高，提高SOD酶的活性而且不影响DOX的抗肿瘤活性，而丹参注射液、参麦注射液和冠心宁注射液对DOX作用下心肌细胞的保护作用不显著。
现有的文献报道黄芪注射液可通过抗氧化作用而对大鼠重症急性胰腺炎肺损伤、大鼠小肠黏膜缺血再灌注的氧化损伤等起到防治作用[6-10]。这些研究均证实使用黄芪注射液能提氧化损伤组织抗氧化酶(如SOD、GSH-PX)等的活性，降低组织MDA含量。香丹注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用,作用机制主要与抗自由基损伤有关[11]。
现有一系列研究也表明丹参注射液、参麦注射液和冠心宁注射液具有明显的抗氧化作用[12-18] ......
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