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编号:12203519
五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠VEGF、bFGF影响及形态学观察的实验研究(2)
http://www.100md.com 2012年3月1日 李巧兰 陈莉
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    参见附件。

     1.3.3主要实验仪器GTK-2002自动恒温摊拷烘片机(西安瑞丰仪器设备有限公司),ZMN-7803自动组织包埋机(西安瑞丰仪器设备有限公司),LQ-A包埋蜡块修整仪(西安瑞丰仪器设备有限公司),YABO600电脑自动脱水机(常州市雅博电子设备有限公司),Motic显微镜及照相系统(Motic公司),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);电热恒温水浴箱(北京西城区医疗器械厂);循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);电热鼓风干燥箱(北京科伟永鑫实验仪器设备厂);电子天平(抚顺宇辰衡器有限公司),手术刀,止血钳,试管等。

    2方法

    2.1动物分组、模型制作及给药

    所有小鼠先适应性喂养7天,后将在无菌条件下接种7天的荷瘤S180腹水瘤小鼠的腹水与PBS液按1∶3的比例进行稀释,离心后弃上清液,并用红细胞计数板计数瘤细胞 [(2~3)×107个/mL],用台盼蓝溶液染色进行活细胞计数,若活细胞率>95%后,在小鼠左腋皮下注射0. 2mL稀释液,制成实体瘤模型。参照《药理实验方法学》[1]将上述已接种S180腹水型肉瘤的昆明种鼠,于接种24h后随机分成4组,为空白组、模型组、CTX组、五叶草莓高、低2个剂量组共5组,各组体重无明显差异。模型组根据体重按0.2mL/10g用生理盐水灌胃1次,环磷酰胺(CTX)按0.04g/kg每天腹腔注射1次,高剂量组按生药量计算为8.26g·kg-1·d-1,用生理盐水将浸膏稀释,予0.4mL/只/日灌胃,低剂量组按生药量计算为4.13g·kg-1·d-1,用生理盐水将浸膏稀释,予0.4mL/只,灌胃,日1次。

    毛色,精神,行动,进食水等一般情况观察。接种14天后小鼠脱臼处死,分别称取小鼠体重,解剖瘤体、脾、胸腺,分别称重,个别组出现提早死亡的动物则提前解剖称重纪录。计算抑瘤率、瘤/体比、脾/体比、胸腺指数和脾指数等[2]。抑瘤率=(C-T) /C×100% T为实验组平均瘤重,C为对照组平均瘤重。胸腺指数=胸腺重/体重,脾脏指数=脾脏重/体重。

    2.2血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)蛋白的测定

    2.2.1标本提取接种14天后断颈脱臼处死荷瘤小鼠解剖瘤体,称重后置于4%多聚甲醛中固定24~48h,常规脱水,石蜡包埋,切片,留做免疫组化。

    2.2.2VEGF bFGF免疫组织化学检测将组织切片置于二甲苯中浸泡10min,更换二甲苯再浸泡10min,常规脱蜡,100%、95%、80% 、70%酒精梯度水化,蒸馏水充分浸洗;3%H2O2室温下封闭30min以灭活内源性过氧化物酶,0.01M PBS(后同)洗10min,2次;滴加正常山羊血清封闭工作液,置湿盒中37℃孵育1h,甩去多余液体,勿洗;滴加适当稀释的VEGF抗体(工作浓度为1∶300),置湿盒中37℃孵育1h,4 ℃过夜;复温至37℃ ,PBS洗10min,2次;滴加生物素标记山羊抗兔IgC,PBS洗10min,2次;DAB显色,70%、80%、95%、100%酒精依次梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。分别以抗体稀释液代替一抗作为阴性对照,在清晰的背景上出现特异性棕黄色颗粒者为阳性,在Motic显微镜下照相,应用计算机图像处理分析技术对免疫组化结果进行半定量分析,通过Motic Digilabii网络版数码显微镜互动教室进行彩色图文分析,测定免疫反应产物VEGF蛋白的平均光密度、积分光密度及平均灰度值,以备统计分析。

    2.3病理组织学观察

    随机取各组小鼠S180瘤块组织标本,经4%多聚甲醛固定24h,经常规脱水、透明、浸腊、包埋,切片HE染色,光镜下观察并拍照,并对各实验组肿瘤细胞种植部位侵袭程度进行组织学分级。

    2.4统计学方法

    各组数据用均数±标准差(±s)表示,应用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,组间比较采用多样本方差分析,两两比较采用t检验,P<0.05为有统计学意义。

    3结果

    3.1各组小鼠抑瘤率对比

    见表1。实验证明各组均有一定的抑瘤作用,以CTX组最为明显,抑瘤率达到51.69%;五叶草莓高、低剂量组抑瘤率分别为45.05%和37.77%(P<0.01)。五叶草莓低剂量组与CTX组比较差异显著(P<0.05)。

    表1五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠的

    抑瘤作用(±s)

    组别n平均瘤重(g) 抑瘤率(%)CTX组100.84±0.10**51.69WYCM高剂量组100.95±0.30**45.05WYCM低剂量组101.08±0.31**37.77模型组101.73±0.47/注:与模型组比较差异显著,*P<0.05;与模型组比较差异显著,**P<0.01。

    3.2各组小鼠胸腺指数及脾脏指数对比

    见表2。胸腺指数:空白组与模型组比较有显著性差异(P<0.01)脾脏指数:五叶草莓高剂量组、空白组的与模型组比较有显著性差异(P<0.01);CTX组与模型组比较有显著性差异(P<0.05);五叶草莓高、低剂量组与CTX组比较,CTX、五叶草莓高剂量组、五叶草莓低剂量组与空白组比较,胸腺指数及脾脏指数均无明显差异(P>0.05),但CTX组P值较小,说明中药五叶草莓对胸腺及脾脏有一定的保护作用,对免疫器官影响小于CTX。

    表2五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠脾脏

    指数与胸腺指数的影响(±s)

    组别n胸腺指数脾脏指数CTX组101.36±0.36*▲4.82±0.89**▲WYCM高剂量组102.13±0.31☆☆ 6.84±1.01☆☆WYCM低剂量组10 2.00±0.59☆☆6.23±0.78☆☆模型组101.86±0.626.06±1.01空白组101.84±0.495.88±1.05注:*表示与模型组比较差异显著(P<0.05);**表示与模型组比较差异显著(P<0.01);☆表示与CTX组比较差异显著(P<0.05);☆☆表示与CTX组比较差异显著(P<0.01);▲表示与空白组比较差异显著(P<0.05)。

    3.3各组小鼠肿瘤细胞VEGF、bFGF表达水平的测定

    灰度系指图像每一像素的明暗(深浅)程度 ......

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