慢性乙肝病毒携带者瘀血阻络型病毒反转录酶区基因突变的研究(2)
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参见附件。
1.3排除标准血清ALT持续或反复升高；合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒；合并酒精性、药物性、自身免疫性、脂肪性肝病；有NA等抗病毒药物治疗史的患者均予以排除。
1.4标本采集采集患者空腹静脉血，分离血清， -20℃冰箱保存备检。
1.5试剂与仪器ABI3130基因分析仪，ABI 7000荧光定量PCR仪， ABI Veriti普通PCR仪，IMx型抗原抗体定量分析仪，上海申友乙型肝炎病毒及耐药突变检测试剂盒。
1.6PCR扩增及基因测序血清标本采用Qiagen公司的试剂盒抽提血清HBV DNA，采用PCR法扩增HBV P基因的RT区，引物序列如下：上游引物5’一TAT GTT TCC CTC TTG TTG CTG一3’；下游引物5’一CTT CCA ATT ACA TAT CCC ATG-3’具体方法如下：第1轮PCR反应体积为40ul,取36ulHBV荧光定量PCR反应液和Taq酶混合物，加入4ulHBV裂解产物，按以下扩增条件进行扩增：42℃ 5min，94℃ 5min；94℃ 5s，60℃ 40s，30个循环；37℃保存。取第1轮PCR产物1μL，加2μL sap试剂，酶解60min,取产物3μL加测序试剂2μL进行第2轮扩增：96℃ 1min；96℃ 10s，50℃ 5s，60℃ 4min 25个循环；4℃保存。扩增产物纯化后进行序列测定。
1.7核苷酸及氨基酸序列分析采用Chromas 2.23软件进行分析。
1.8统计方法采用SPSS 13.0统计软件，计量资料用±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组患者HBeAg和HBVDNA水平的比较见表1。慢性HBV携带者瘀血阻络组HBeAg水平和HBVDNA载量均低于无症可辨组，两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。
表1两组患者HBeAg 和HBVDNA水平的比较
组别例数HBeAg(S/CO)HBVDNA(cops/mL)瘀血阻络组30732.3±197.8*6.2±0.82*无症可辨组30825.6±246.77.8±0.64注: 瘀血阻络组与无症可辨组比较， t =2.268和3.908 ，*P<0.05。
2.2两组患者基因突变的分布瘀血阻络组中3例发生HBV RT区基因突变，突变类型：1例 rtV173L +rtL180M+rtM204V，1例 rtS213T，1例rtV214I；无症可辨组未发现HBV RT区基因突变。
3讨论
我国慢性HBV携带者众多，超过75%的患者有不同程度的肝脏损害[3]，约10%的患者会进展为肝硬化或肝癌[4]。慢性HBV携带者的形成是由于机体免疫系统功能低下,无法清除HBV而产生免疫耐受，此时肝功能正常，机体对NA等抗乙肝病毒药物治疗应答不佳[5-6]，所以我国的《慢性乙型肝炎防治指南》要求对其进行医学管理，定期检查，一旦肝功能异常或肝脏病理损伤达到一定程度，才可以抗病毒治疗。由于肝脏病理活检很难为大多数患者接受，肝功能正常而肝组织进行性损害的现象屡见不鲜，这势必造成部分患者延误病情。对慢性HBV携带者进行医学干预，明确未经治疗的慢性HBV携带者是否存在常见NA耐药位点的基因突变，明确这种基因突变是否和中医证型有关，为今后抗病毒治疗提供理论依据，避免抗病毒治疗过程中的耐药和应答不佳，具有重要意义。
临床上较多慢性HBV携带者没有自觉症状，舌苔脉象也无异常，属于无症可辨型，给中医辨证论治造成很大困难。在有症状的慢性HBV携带者中，根据中医辨证分型标准，可分为湿热中阻型、肝郁脾虚型、肝肾阴虚型、瘀血阻络型和脾肾阳虚型。瘀血阻络型临床并不罕见，其病因病机为湿热痰瘀羁留日久，胶结不解，迁延不愈，耗伤正气，阻滞经络。大量临床研究发现，瘀血阻络型患者肝组织病理损伤较其他分型严重[7]，部分患者虽然肝功能始终无异常，但肝组织已存在较为严重的炎症坏死和纤维化，危害较大。
本研究发现，在未经乙肝相关药物治疗的慢性HBV携带者中，瘀血阻络型的HBeAg和HBVDNA水平较无症可辨组低，差异有统计学意义(P<0.05)，这可能与机体的免疫清除有关。
PCR产物直接测序法为基因诊断的金标准[8]，通过对PCR产物进行直接测序可以判断基因突变。本研究发现：无症可辨组病毒核苷酸序列均为野生株，未发现基因突变；瘀血阻络组发现3例患者HBV RT区基因突变，突变类型：1例rtV173L+rtL180M+rtM204V，1例rtS213T，1例rtV214I，同时还发现变异和未变异序列共存、不同变异序列共存的现象。提示：第1例患者已存在对拉米夫定和替比夫定的耐药，第2例患者可能存在对拉米夫定的耐药，第3例患者可能存在对阿德福韦的耐药，这3例患者今后如进行抗病毒治疗，应尽量避免上述药物单用，以免发生耐药和应答不佳。因基因测序费用较贵，故未对其他中医分型进行比较，有待今后开展。
参考文献
[1]中华医学会肝病学分会.中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[S].中华临床感染病杂志杂志,2011,4(1):1-13.
[2]中国中医药学会内科肝病委员会 ......
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