清热化湿法对非酒精性脂肪性肝炎大鼠的影响(2)
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参见附件。
2.3取材
A组大鼠普通饲料喂养12周。B、C、D组给药4周(即实验12周)，末次给药后，禁食12h，迅速自眼眶静脉丛取血，常规分离血清及留取肝组织。
2.4指标检测
2.4.1血清生化测定用Olympus Au560全自动生化分析仪检测血清TG、TCH、LDL、ALT、AST水平。
2.4.2肝组织病理脂肪变性和炎症活动程度评估将肝组织用4℃生理盐水冲洗，于肝脏最大叶距边缘5mm处取小块肝组织，中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察，评估脂肪变性和炎症活动程度。肝细胞脂肪变程度作以下分级[2]：重度：脂变肝细胞超过肝小叶2/3；中度：脂变肝细胞占肝小叶1/3～2/3；轻度：脂变肝细胞呈散在小灶分布；无：肝小叶结构完好，基本无脂变。炎症活动度计分标准参考王泰龄等提出的慢性肝炎炎症活动计分方案[3]：分为汇管区炎症(P)、小叶内炎症(L)、碎屑样坏死(PN)、桥接坏死(BN)4项，每项依病变程度分别计以1、2、3、4分，因为PN、BN严重度与预后直接相关，因而计分2倍于其他病变，计分公式为P+L+2PN+2BN。
2.5统计学处理
计量资料数据均以±s形式表示，采用SPSS 11.0统计软件进行t检验统计学分析，等级资料采用秩和检验。
3结果
3.1各组大鼠血脂和肝功能的结果比较
与模型组相比，东宝肝泰能明显降低NASH大鼠的TG，TCH水平(P<005)。杞蓟制剂组大鼠血清TG，TCH，ALT，AST明显降低(P<0.01)，作用优于东宝肝泰组(P<0.05)。结果见表1。表1各组大鼠血脂和肝功能的比较(±s)
组别nTG(mmol/L)TCH(mmol/L)LDL(mmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)A100.25±0.0141.48±0.150.19±0.02067.55±25.0266.73±30.23B100.43±0.0404.63±0.521.30±0.056145.78±38.67149.82±38.03C100.30±0.035*△△3.08±0.64*△△0.80±0.053*△△105.36±34.02*△△110.53±37.65*△△D100.34±0.033△)3.85±0.70△0.86±0.056△138.30±27.67△145.25±36.05△注：与模型组比较，△P<0.05，*P<0.01；与东宝肝泰比较，△△P<0.05。
3.2各组大鼠肝组织病理观察
3.2.1肉眼观察A组大鼠肝脏形态正常，呈鲜红色，边缘锐利，表面光滑。B组大鼠肝脏体积明显增大,外形饱满，包膜紧张，切面油腻，包膜紧张，边缘较钝，触之有油腻感，C、D组大鼠肝脏体积、质地、色泽均明显改善。
3.2.2光镜观察A组肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状排列,肝小叶汇管区基本结构包括小叶间胆管、小叶间动脉、小叶间静脉清晰可见，未见肝细胞脂肪变性及炎性细胞浸润，见插页Ⅶ图1。B组大鼠NASH模型复制率为100%。模型组大鼠所有标本的肝组织切片均可见弥漫性肝细胞脂肪变性,主要为小泡性脂肪变性,也有部分大泡性脂肪变性。脂肪变性的肝细胞胞浆内充满脂肪空泡，脂滴大小不等，将细胞核挤压在细胞边缘，肝窦狭窄。部分肝细胞呈气球样变,少数呈嗜酸性变。肝小叶内和汇管区有炎性细胞浸润，以小叶内炎症为主，部分大鼠肝组织小叶内坏死灶融合成片，2例见碎屑样坏死，未见桥接坏死和纤维化改变，见插页Ⅶ图2。C、D组肝小叶和肝血窦结构较清晰，肝细胞脂肪变均有不同程度的改善趋势，也有肝细胞呈气球样变，炎症性质与模型组基本相似，但程度明显减轻，未见碎屑样坏死、桥接坏死和纤维化改变，见插页Ⅶ图3～4。B组肝细胞嗜酸性变见插页Ⅶ图5，B组肝细胞碎屑样坏死见插页Ⅶ图6，D组肝细胞气球样变见插页Ⅶ图7，D组肝细胞嗜酸性变见插页Ⅶ图8。各组大鼠肝组织脂肪变性和炎症活动程度比较见表2。
表2各组大鼠肝组织脂肪变性和炎症活动程度比较
组别n肝细胞脂肪变性程度-++++++炎症活动度计分
(±s)A10100000B10004 65.48±2.71C10045 1*△△2.32±1.13*△△D10015 4△3.97±1.84△注：与模型组比较，△△P<0.01，△P<0.05；与东宝肝泰防治组比较，＃P<0.01。
4讨论
针对当今社会NASH最常见的病因是肥胖、高脂血症和糖尿病，2006年2月，中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组在参考国内外最新研究成果的基础上，按照循证医学的原则，制定了《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》,将非酒精性脂肪性肝病定义为除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征。2006年的指南进一步强调NAFLD是遗传-环境-代谢应激相关性疾病。NASH是几乎没有饮酒史，但肝组织具有类似于酒精性肝炎的肝脂肪变性和炎症的病症[4]。组织病理是NASH诊断的重要依据,其在病理组织学上表现为：肝细胞脂肪变性；肝细胞气球样变；小叶内混合性炎症细胞浸润，或小叶内炎症重于汇管区；可伴有或无肝细胞坏死、Mallory小体和肝窦周纤维化。脂肪肝、肝细胞变性、脂肪性肝炎为NASH时的主要病理特征[5-8]。
NASH的造模方法比较多，有营养失调性、药物性、中毒性、特殊种系动物等NASH模型。目前NASH需排除病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性等可导致脂肪肝的特定疾病，所以国内外曾经许多模型与现在人类肥胖、高脂血症和糖尿病为高发因素的NASH发病情况大相径庭，也已不符合NASH诊断标准。钟岚等对国内外已有能诱发脂肪肝模型的高脂饲料配方进行了改良，加大其中胆固醇及猪油所占比例，建立的NASH动物模型方法简单,重复性好，并与人类NASH相似,在造模过程中,无实验动物死亡，成功率高，该模型是研究NASH的发病机制和筛选防治方案的理想动物模型。非酒精性脂肪性肝病的形成符合温病对湿热证发病的理论，我们根据《温病学》湿热证的发病理论“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热”的理论采用了钟岚等方法复制大鼠NASH动物模型，3月后模型组大鼠所有标本的肝组织切片病理改变基本符合NASH病理变化，NASH复制率100%。
本实验运用祛湿清热法，选用对脾胃湿热有良好效果的王氏连朴饮加减干预NASH大鼠,并用目前疗效肯定的东宝肝泰(复方蛋氨酸胆碱片)作为对照。结果显示：东宝肝泰能明显降低NASH的TG、TCH、LDL水平(P<0.05)，但未能改善肝脏脂肪变性和炎症活动程度(P>0.05)。与空白模型组相比，清热化湿方防治组血清TG、TCH、LDL、ALT、AST明显降低(P<0.01)，脂肪变性和炎症活动程度明显改善(P<0.01)，部分作用优于东宝肝泰组(P<0.01)。提示清热化湿方能够有效改善实验性大鼠NASH肝脏功能和肝组织炎性改变，部分作用东宝肝泰。其防治NASH的作用机理有待进一步探讨。
参考文献
[1]钟岚 ......
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