天仙子多糖提取工艺(2)
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参见附件。
2.1.4硫酸加入量的选择分别精密量取葡萄糖对照品溶液1mL共7份，按苯酚-硫酸法，分别加入苯酚1.2mL，加入浓硫酸4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5mL，在490nm测定其吸收度，结果表明：浓硫酸加入量为7mL时，反应基本完全，故浓硫酸加入量确定为7mL。
2.1.5标准曲线的制备精密量取葡萄糖标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL分别置于10mL具塞刻度试管中，各加入5%苯酚溶液1.2mL，充分摇匀，然后加浓硫酸7mL，充分摇匀，再加蒸馏水至刻度，充分摇匀。另取1.0mL的蒸馏水同上操作制得空白溶液。在490nm波长处测定吸收度值，得标准回归方程为Y=1.6334X+0.0283(r=0.9997)，表明样品在此范围内线性关系良好。
2.1.6稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、15、30、60、120min，测定吸收度，结果表明，在2h内基本无变化。
2.1.7重现性试验取同一批样品6份，分别测定吸收度，计算含量，结果测得含量的RSD为0.15%。
2.1.8加样回收率试验精密称取已知含量的样品，共5份。分别加入葡萄糖对照品约5 mg，定容至50 mL，按“2.1.5”项下方法操作，结果平均回收率为99. 79%， RSD为0.84%。
2.2提取工艺的优选[13]
取天仙子药材粉碎，过3号筛，精密称取粉末约10g，4份，置具塞锥形瓶中，分别按下述4种方法进行提取。方法1：加水8倍量，回流提取3次，每次1h，滤过，合并提取液，备用；方法2：加水8倍量，浸提24 h，滤过，备用；方法3：加95%乙醇6倍量，回流提取2次，每次1h，弃去醇液，药渣加水8倍量，回流提取3次，每次1h，滤过，合并提取液，备用；方法4：加95%乙醇6倍量，回流提取2次，每次1 h，弃去醇液，药渣加水8倍量，浸提24h，滤过，备用。
取上述备用提取液均浓缩至50 mL，加95%乙醇300 mL，静置过夜，离心(3000r/min，15min)，取沉淀，分别依次用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤数次，置真空干燥箱中50℃真空干燥5h，至天仙子粗多糖重量不再变化，精密量取天仙子粗多糖50mg，用蒸馏水溶解并定容到100mL，按“2.1”项下的多糖含量测定方法进行测定，并计算含量，结果多糖含量分别为1.396%、0.574%、1.979%、0.913%。由此可见，方法3的多糖含量高于其他3种方法，故确定方法3为最佳提取方法。
2.3正交试验
2.3.1正交设计与结果影响水提取多糖的因素很多，结合预实验结果，选择4个主要因素，即：加水量、提取时间、提取温度、提取次数，每个因素各设定3个水平，按4因素3水平进行L9(3)4正交试验，因素与水平见表1。取天仙子药材粉碎，过3号筛，精密称取约100g，以95%乙醇6倍量回流提取2次，脱脂，每次1h，滤过，挥干溶剂，得药渣81.50g，得率81.5%。取上述药渣共9份，各9g，分别置于250mL具塞锥型瓶中，按表2的条件进行提取，滤过，合并滤液，并浓缩至50mL，加95%的乙醇300mL，搅拌，4℃过夜，离心(3000r/min，15min)，沉淀依次用95%乙醇、无水乙醇、丙酮反复洗涤，真空干燥，得天仙子粗多糖，按“2.1”项下方法进行测定，并计算含量，结果见表2。
表1因素水平表
水平A料液比/
(倍)B提取时间/
(h)C提取温度/
(℃)D提取次数/
(次)16160128 1.5802310 210032.3.2正交试验结果分析方差分析结果见表3。从表2、表3可知，影响天仙子多糖提取率的因素的顺序均是：C>A>D>B。其中方差分析显示，C即提取温度对天仙子多糖提取的影响较大；直观分析的多糖提取最佳工艺为A3B3C3D3，但B项影响因素较小，B1，B2与B3结果均相当，考虑到节约时间，最终确定最佳工艺A3B1C3D3，即加水10倍量水、100℃回流提取3次、每次1h。
表2正交实验结果表
编号ABCD多糖含量(%)111111.473212221.763313332.201421231.755522311.962623121.539731322.089832131.813933211.853K11.8121.7731.6081.736K21.7521.8461.7911.797K31.9181.8642.0841.923R0.1660.0910.4760.160表3方差分析结果
方差来源偏差平方和自由度F值显著性A0.04223.000B0.01421.000C0.346224.714*D0.04323.0710.012注：F0.05(2，2)=19.00，*P<0.05。
3讨论
天仙子中含有皂苷类成分，为此提取多糖时，先采用95%的乙醇回流提取2次，以除去大部分皂苷，有利于多糖提取液的减压浓缩(皂苷含量过高会产生大量泡沫)，而且还能除去大量脂肪油及一部分单糖、寡糖等小分子物质，以利于多糖的提取及纯化。
苯酚-硫酸法以及蒽酮-硫酸法是较为常用的两种多糖含量测定的方法，这两种方法各有优缺点，蒽酮-硫酸法的缺点是蒽酮试剂不稳定，需要临用前配制，不适用于大量样品的测定，但是测量少量样品优于苯酚-硫酸法；而苯酚-硫酸法的缺点是苯酚容易氧化，配制前苯酚需要重新蒸馏收集进行纯化处理，否则影响结果的准确度，只要注意苯酚溶液的避光保存，可以进行大量样品的处理，综合考虑两种方法的优缺点，结合本实验的特点，最终采用了苯酚-硫酸法进行测定，实验结果显示苯酚-硫酸法的线性良好，适用于多糖的含量测定[14-15]。
多糖类化合物是许多中草药的有效成分之一 ......
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