芍药软肝方对荷肝癌H22小鼠肿瘤组织TGF-β1RⅡ、NF-κB、VEGF表达的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
近年来，随着分子生物学、细胞生物学、遗传学等的发展，人们对中医药防治肝癌作用机制的研究已上升到了基因、细胞信号转导等微观水平。越来越多的中药抗肿瘤的分子机制被揭示，在中医传统辨证论治的基础上根据作用靶点来进行中药的有机组合，提高中医治疗肝癌的疗效[5]。前期研究表明，芍药软肝方对H22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠有明显的抑瘤作用，然而确切的机制尚未明确。本实验采用荧光定量PCR法评价了芍药软肝方对H22肝癌肿瘤组织中TGF-β1RⅡ、NF-κB、VEGF基因表达的影响，进一步探索其分子机制，为该药的临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物与细胞株
H22肝癌细胞株(浙江中医药大学药学院药理教研室惠赠)； ICR小鼠，SPF级，年龄：4～6周，体重18～22g。购自中科院上海实验动物中心(合格证号：SCXK(沪)-2007-0005)，饲养于浙江中医药大学实验动物中心。
1.2 药品
芍药软肝方：根据浙江省肿瘤医院中药制剂室提供的处方和制备工艺自制。浓度以投入生药重量计算，成品浓度为1g/mL，根据给药剂量和给药体积配制成相应浓度。注射用环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)：批号：德国Baxter Oncology Gmbh公司，9F586E。
1.3 试剂
TRIzol试剂(购自美国Reagent公司)；小鼠TGF-β1RⅡ、NF-κB、VEGF荧光定量RT-PCR检测试剂盒(购自广州市达晖生物技术有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 H22肝癌小鼠模型制备、分组与给药方式
取体重(20±2)gICR小鼠50只，雄性。无菌条件下取接种H22瘤株7-10天的小鼠的腹水(为乳白色浓稠腹水瘤液，若为黄色或红色则应弃去不用)，以生理盐水稀释，调细胞浓度至1×107个/mL。按0.2mL/只接种于小鼠前肢右腋皮下。接种后随机分为阳性对照组、阴性对照组、芍药软肝方低剂量组、芍药软肝方中剂量组、芍药软肝方高剂量组。每组10只。接种24h后阴性对照组采用0.2mL/10g生理盐水灌胃，每天1次。阳性对照组采用环磷酰胺腹腔注射，20mg/kg，每天1次。芍药软肝方低、中、高剂量组分别给予芍药软肝方原液(20g/kg)、芍药软肝方两倍浓缩液(40g/kg)、芍药软肝方四倍浓缩液(80g/kg)灌胃给药，0.2mL/10g，每天1次。8日后停药。停药次日处死动物，剥离皮下瘤体，快速放入液氮中保存后，转移至-70℃低温冰箱保存待用。
1.4.2 荧光定量RT-PCR测定 (1)肿瘤组织总mRNA提取：①取保存在-70℃低温冰箱中的瘤体组织；取50-100mg组织，置1.5mL离心管中，加入1mLTrizol充分匀浆，室温静置5min。②加入0.2mL氯仿，振荡15s，静置2min。③低温4℃离心，12000r/min×15min，取上清液。④加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。⑤低温4℃离心，12000r/min×10min，弃上清液。⑥加入1mL75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7500r/min×10min，弃上清液。⑦晾干，加入适量的DEPCH2O溶解(65℃促溶10～15min)。⑧在紫外分光光度计中测量RNA含量和纯度(260nmOD值)。⑨放置-70℃冰箱待用。
(2)逆转录反应：按试剂盒说明操作进行。反应条件：37℃60min，95℃3min。
(3)实时荧光定量PCR扩增：按试剂盒说明操作进行。反应条件：93℃→3min变性，然后按93℃45s→55℃60s，共做40个循环。
(5)结果分析：选阳性标准点分析，若相关系数R2大于0.96，表明线性关系良好，可确定为定量标准曲线，根据标准曲线得出样本荧光定量反应的绝对定量值(cDNA浓度拷贝数/μL)。
1.5 统计学处理
运用SPSS 16.0软件对相关数据进行统计学处理。计量资料采用±s表示，两组间计量资料采用t检验。
2 结 果
2.1 芍药软肝方对 H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织TGF-β1RⅡmRNA表达的作用。
荧光定量RT-PCR标准曲线为：Y=-3.8371LgX+44.2261，R2=0.998。标准曲线符合说明书规定相关系数R2>0.96，线性关系良好。见图1。
图1 荷H22肝癌小鼠肿瘤组织织TGF-β1RⅡ
表达的标准曲线
TGF-β1RⅡ表达以中剂量组最高，高剂量组次之；CTX组较低；低剂量组和荷瘤生理盐水对照组表达相近，为最低；中剂量组、高剂量组和CTX化疗组与生理盐水对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。2.2 芍药软肝方对 H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织NF-κB mRNA表达的作用
荧光定量RT-PCR标准曲线为：Y=-3.6864LgX+44.4837，R2=0.997。标准曲线符合说明书规定相关系数R2>0.96，线性关系良好。见图2。
各组NF-κB的表达高低顺序为生理盐水组>低剂量组>中剂量组>CTX治疗组>高剂量组。低剂量组、中剂量组、高剂量组和CTX组与生理盐水对照组相比均有非常显著的差异(P<0.01)。高剂量组与CTX化疗组相比有非常显著的差(P<0.01)。
2.3 芍药软肝方对 H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织VEGF mRNA表达的作用
荧光定量RT-PCR标准曲线为：Y=-3.3487LgX+41.8063，R2=0.988。标准曲线符合说明书规定相关系数R2>0.96，线性关系良好。见图3。
VEGF表达以荷瘤阴性对照组最高；芍药软肝方低剂量组与中剂量组次之；芍药软肝方高剂量组与CTX阳性对照组表达相近，为最低；高剂量组和CTX化疗组与生理盐水组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，高剂量组与CTX化疗组相比，无显著性差异(P>0.05)。见表3。
3 讨 论
随着基因组学、蛋白组学技术在肝癌的早期发现、术后复发、转移监测，正向高度灵敏、特异诊断方向发展的应用。肝癌进展与肝组织中多种生长因子(IGF-Ⅱ、VEGF、TGF-β1、NF-κB和HGF)的过表达密切相关，其分子机制复杂[6-7]。前期实验表明，芍药软肝方对H22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠有明显的抑瘤作用 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(3363kb)。